Что важно знать, чтобы эксперимент получился?

Save this PDF as:
 WORD  PNG  TXT  JPG

Размер: px
Начинать показ со страницы:

Download "Что важно знать, чтобы эксперимент получился?"

Транскрипт

1 Что важно знать, чтобы эксперимент получился? Ирина Карпова, РошДиагностика Рус picture placeholder

2 LightCycler 96: подходы и возможности Абсолютный количественный анализ Качественный анализ Относительный количественный анализ HRM-анализ Генотипировани е по конечной точке LightCycler 96

3 Области применения qpcr Качественный анализ (есть/нет) Абсолютный количественный анализ (кол-во копий) Относительный количественный анализ (анализ экспрессии генов, анализ микробных сообществ ) Генотипирование (поиск известных мутаций) Поиск неизвестных мутаций (HRM-анализ) 3

4 Качественный анализ «есть/нет» ВК 2+ВК Контроль положительный Контроль отрицательный Внутренний Контроль 1+ВК? 2+ВК? 4

5 Качественный анализ Ключевые особенности: Снижение риска контаминации => предупреждение ложных результатов Возможность контроля отсутствия ингибирования в одной пробирке с мишенью (мультиплекс) Возможность детекции нескольких мишеней в одной пробирке 5

6 Области применения qpcr Качественный анализ (есть/нет) Абсолютный количественный анализ (кол-во копий) Относительный количественный анализ (анализ экспрессии генов, анализ микробных сообществ ) Генотипирование (поиск известных мутаций) Поиск неизвестных мутаций (HRM-анализ) 6

7 Абсолютный количественный анализ Цель определить изначальное количество копий в реакционной смеси 7

8 График амплификации 8

9

10 Концентрации и циклы Цикл, на котором флуоресценция реакции выше фоновой флуоресценции называется пороговым циклом Cq 10

11 Метод определения Cq в LightCycler 96 11

12 Стандартная кривая Серия разведений образца с известной концентрацией Представление результатов в виде прямой зависимости Cq от логарифма концентрации 12

13 Виды стандартов Очищенный RT-PCR-продукт. Рекомбинантная ДНК (плазмида с целевым фрагментом) Коммерческая геномная ДНК. Синтетический олигонуклеотид, содержащий амплифицируемую последовательность.

14 Виды стандартов: достоинства и Виднедостатки стандартов Достоинства Недостатки Очищенный RT-PCRпродукт Дешево Быстрота пробоподготовки Нестабильность, падение концентрации при длительном хранении Сложно определить точную концентрацию Высокая вероятность контаминации в процессе пробоподготовки Рекомбинантная ДНК (плазмида с целевым фрагментом) Коммерческая геномная ДНК Стабильность при длительном хранении Дешево Стабильность при длительном хранении Известна точная концентрация Низкая вероятность контаминации других образцов в процессе пробоподготовки Сложно определить точную концентрацию Много времени занимает процесс приготовления стандарта Дорого Доступно не для всех организмов Синтетический олигонуклеотид, содержащий амплифицируемую последовательность Известна точная концентрация Точная длина продукта Возможность получить сразу большое количество материала Нестабильность, падение концентрации при длительном хранении Высокая вероятность контаминации в процессе пробоподготовки Ограничение по длине продукта

15 Стандартная кривая Концентрация образца вычисляется исходя из Cq образца с Cq стандартов известной концентрации. 15

16 Эффективность ПЦР N = N 0 x 2 n E 16

17 Факторы, влияющие на эффективность реакции Дизайн праймеров Длина фрагмента, содержание GC Чистота образцов, присутствие ингибиторов Компоненты ПЦР реакции 17

18 Особенности дизайна праймеров Длина праймеров нуклеотида Температура отжига (Ta) должна быть примерно 60-70ºС Ta праймеров находящихся в паре должна одинакова Рекомендовано, чтобы температура плавления 5 -концевой части праймера была выше температуры плавления 3 -концевой части праймера

19 Особенности последовательности праймеров Последовательность праймера не должна содержать повторов и протяженных участков из одного типа нуклеотидов Последовательность должна включать больше пиримидинов чем пуринов (пурины при синтезе праймера дают худшее качество олигонуклеотида) Четыре или более 3 -концевых нуклеотида не должны быть комплементарны самому праймеру, праймеру в паре, зонду для избежания образования димеров праймеров Праймер не должен образовывать шпиличные структуры 3 -регион праймера должен содержать «редкую» последовательность

20 Требование при проведении количественного анализа E стандарт = E образец 20

21 Влияние эффективности ПЦР на интерпретацию данных ЭФФЕКТИВНОСТЬ СТАНДАРТОВ ДОЛЖНА СОВПАДАТЬ С ЭФФЕКТИВНОСТЬЮ ОБРАЗЦОВ!!! 21

22 22

23 23

24 Чем больше повторностей и разведений тем точнее стандартная кривая 15 стандартов: 5 концентраций по 3 повторности 24

25 Абсолютный количественный анализ Ключевые особенности: Возможность измерить изначальную концентрацию целевого участка ДНК в исследуемой пробе. Автоматическое построение калибровочной кривой, учет эффективности реакции амплификации Для калибровки метода необходимо иметь стандарты - образцы с известной концентрацией. 25

26 Области применения qpcr Качественный анализ (есть/нет) Абсолютный количественный анализ (кол-во копий) Относительный количественный анализ (анализ экспрессии генов) Генотипирование (поиск известных мутаций) Поиск неизвестных мутаций (HRM-анализ) 26

27 Относительный количественный анализа задача: оценить уровень экспрессии гена-мишени в экспериментальной системе необходимо: концентрация гена-мишени гена концентрация референсного (ген-сравнения) Таргетный ген (T) ген, уровень экспрессии которого анализируют Референсный ген ( R ) ген, уровень экспрессии которого стабилен в анализируемой клетке/ткани normal = calibrator T = 1000 T = 100 T = 10 = 2 = 2 = 0.2 R = 500 R = 50 R = 50 Калибратор любой положительный образец (положительный по таргетному и референсному гену) не подвергавшаяся обработке клеточная линия образец в момент t=0 нормальная ткань 27

28 Анализ экспрессии генов Основные этапы эксперимента и факторы, влияющие на анализ??? Эффективность Особенности прибора, формата и настроек детекции, концентрация красителя 28

29 Референсные гены контроль процесса пробоподготовки Гены домашнего хозяйства (Housekeeping genes) (Гены домашнего хозяйства кодируют ферменты общего метаболизма) Условия: экспрессия этих генов не зависит (или слабо зависит) от условий эксперимента и поддерживается на постоянном уровне Математически можно использовать один или несколько референсных генов 29

30 Выбор красителя Интеркалирующий краситель SYBR Green I Гидролизные зонды отжиг праймеров элонгация конец элогации денатурация отжиг праймеров и зонда элонгация конец элогации 30

31 Анализ экспрессии генов Выбор формата детекции 13

32 Вычисление результатов! Значения «Ratio» сравнимы только внутри одного запуска прибора! Для сравнения результатов между несколькими запусками, при смене прибора, мастер-микса или праймеров можно сравнивать только «Normalized Ratio» при нормализации в каждом запуске на один и тот же калибратор.

33 Эффективность ПЦР Е=10 (- 1/slope) 33

34 Относительный количественный анализ Алгоритмы «ΔΔCt» метод Livak et al (2001) Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the ΔΔCT Method E-model. Учтена эффективность каждого гена (1 референс) Pfaffl M.W. (2001) A new mathematical model for relative quantification in real-time RT PCR qbase Plus. Учтена эфективность всех генов. (несколько референсов) 34

35 Относительный количественный анализ Алгоритмы ΔCt ΔΔCt E-model qbase Особенности Не проводится нормализация на референсный ген. Проводится нормализация на референс, но не учитывается эффективность Нормализация проводится на один референсный ген и учитывается эффективность вмплификации Проводится нормализация сразу на несколько референсов Потенциальная ошибка метода более 10 раз Ошибка до 10 раз До 10%. Не дает возможности детектировать дрейф референсных генов. До 10% 35

36 Относительный количественный анализ Области применения: Анализ изменения уровней экспрессии генов в результате воздействия на исследуемый образец (ткани/клетки) Возможность анализа различий структуры микробных сообществ Ключевые особенности: Отсутствие необходимости иметь стандартные образцы с известной концентрацией. Для нормализации данных используется референсный ген и калибратор запуска qpcr. 36

37 Области применения qpcr Качественный анализ (есть/нет) Абсолютный количественный анализ (кол-во копий) Относительный количественный анализ (анализ экспрессии генов, анализ микробных сообществ ) Генотипирование (поиск известных мутаций) Поиск неизвестных мутаций (HRM-анализ) 37

38 Генотипирование поиск известных мутаций А С Wild Type Mutant 38

39 Генотипирование генотипирование по конечной точке T T G G FAM VIC А С OK! OK! 39

40 Генотипирование генотипирование по конечной точке А А С С 40

41 Генотипирование генотипирование по конечной точке C C A C С А A A 41

42 Генотипирование генотипирование по кривым плавления Fluorescein T С С А

43 Генотипирование генотипирование по кривым плавления T C

44 Генотипирование генотипирование по кривым плавления 44

45 Генотипирование (поиск известных мутаций) Возможные подходы и их особенности: Аллель-специфичные праймеры Используется краситель SybrGreen. Необходимо минимум 2 реакции на образец. Генотипирование с 2-мя TaqMan зондами (генотипирование по конечной точке). Анализ вариантов гена для одного образца в единственной пробирке. Генотипирование по кривым плавления с HybProbe зондами Возможность анализа до 3-х мутаций в одном образце, используя всего 1 реакционную ячейку (мультиплексирование). (Только для LC480) 45

46 Области применения qpcr Качественный анализ (есть/нет) Абсолютный количественный анализ (кол-во копий) Относительный количественный анализ (анализ экспрессии генов, анализ микробных сообществ ) Генотипирование (поиск известных мутаций) Поиск неизвестных мутаций (HRM-анализ) 46

47 Анализ кривых высокого разрешения AC CC AA С помощью анализа кривых плавления высокого разрешения возможно определять гетерозиготную и гомозиготную формы мутации в ПЦР продукте с высокой специфичностью и чувствительностью

48 Анализ кривых высокого разрешения Анализ кривых плавления позволяет определять наличие вариаций в исследуемом фрагменте, при условии, что есть референс, в котором достоверно известно наличие/отсутствие вариации; либо анализируется достаточно большое количество образцов Анализ кривых плавления не позволяет определять какой именно тип мутации (SNP, инделы и т.д.) в исследуемом образце Анализ кривых плавления не позволяет определять точное место положение мутации, только наличие/отсутствие в амликоне С помощью анализа кривых плавления высокого разрешения возможно определять гетерозиготную и гомозиготную формы мутации в ПЦР продукте с высокой специфичностью и чувствительностью

49 HRM Анализ кривых плавления высокого разрешения. F Идентификация ПЦР-продукта с SYBR Green I Поиск мутаций с HRM красителем 49

50 HRM Анализ кривых плавления высокого разрешения. SybrGreen I 50

51 HRM Анализ кривых плавления высокого разрешения. ResoLight 51

52 HRM Анализ кривых плавления высокого разрешения. Требования к компонентам реакции: - насыщающая концентрация красителя - отсутствие ингибирования AC полимеразы - длина ПЦР-продукта bp CC - единственный ПЦР продукт AA 52

53 HRM Анализ кривых плавления высокого разрешения. Класс замен ы 1 Замена C/T или G/A Частота встречаемости в геноме человека 64% 2 C/A или G/T 20% Наиболее частый сдвиг Tm Значительный (>0.5 C), обычно 1.0 C Значительный (>0.5 C), обычно 1.0 C 3 C/G 9% маленький ( C) 4 A/T 7% Очень маленький (<0.2 C)! 53

54 LightCycler 96 при HRM-анализе 1. Сверх высокое разрешение кривой плавления: считывание сигнала с шагом 0,04ºС 2. Возможность регулирования чувствительности определения ΔTm, и формы кривой

55 Программное обеспечение LightCycler 96 при HRM-анализе 1. Программное обеспечение проводит автоматический анализ данный нормализуя кривые плавления, и распределяя образцы по группам в зависимости от профиля кривых 2. Возможность построения Нормализованных пиков плавления позволяет повысить точность анализа при большом количестве образцов

56 Поиск мутаций High Resolution Melting (HRM) Области применения: Поиск участков гена, содержащих полиморфизмы. Возможность обнаружения однонуклеотидных замен (SNP) 56

57 Doing now what patients need next

58 Методы вычисления Cq метод второй производной метод Fit Point (threshold) метод LC96 58

59 Метод второй производной Флуоресцентны й сигнал первая производная вторая производная Сq

60 Методы вычисления Cq метод второй производной (автоматический) метод Fit Point (threshold частный случай) метод LC96 60

61 Метод Fit Points Метод Fit Points позволяет пользователю выполнять: Настройку уровня шума Выбор количества точек Настройка порога (Threshold) 61

62 Методы вычисления Cq метод второй производной (автоматический) метод Fit Point (threshold частный случай) метод LC96 62

63 Методы определения Cq Если у вас качественно подобраны праймеры и/или зонды все алгоритмы вычисления Cq дают одинаковые результаты. Ручная корректиовка алгоритмов вычисления Cq нужна только для того, что бы обойти артефакты измерений => выше ошибка измерений. 63

64 Doing now what patients need next