С.Н. Плескова Нижний Новгород 2011

Save this PDF as:
 WORD  PNG  TXT  JPG

Размер: px
Начинать показ со страницы:

Download "С.Н. Плескова Нижний Новгород 2011"

Транскрипт

1 С.Н. Плескова Нижний Новгород 2011

2 Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное учреждение высшего профессионального образования «Нижегородский государственный технический университет им. Р.Е. Алексеева» С.Н. ПЛЕСКОВА ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ Рекомендовано Ученым советом Нижегородского государственного технического университета им. Р.Е. Алексеева в качестве учебного пособия для студентов, обучающихся по направлениям подготовки и Биотехнология Нижний Новгород

3 УДК 575/577 ББК П 382 Рецензент доктор биологических наук, профессор, академик РАЕН, директор НИИ молекулярной биологии и региональной экологии В.В. Новиков Плескова С.Н. П382 Основные принципы генной инженерии: учеб. пособие / С.Н. Плескова; НГТУ им. Р.Е. Алексеева. Нижний Новгород, с. ISBN Рассмотрены технологии получения и экспрессии рекомбинантного белка генно-инженерными методами. Перечисляются основные ферменты, с помощью которых осуществляются получение рекомбинантных ДНК. Подробно рассмотрены основные векторы для трансформации бактериальных клеток. Представлены наиболее распространенные системы экспрессии на основе эукариотических клеток. Предназначено для бакалавров, магистров и аспирантов, обучающихся по направлению «Биотехнология». Рис. 34. Табл. 1. Библиогр.: 12 назв. УДК 575/577 ББК ISBN НГТУ им. Р.Е. Алексеева, 2011 Плескова С.Н., 2011 ОГЛАВЛЕНИЕ 4

4 ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ... 6 ВВЕДЕНИЕ ТЕХНОЛОГИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК Значение рестриктирующих эндонуклеаз для генетической инженерии Методы конструирования рекомбинантных ДНК Применение векторов в генетической инженерии ТРАНСФОРМАЦИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ОТБОР ГИБРИДНЫХ КЛОНОВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК СОЗДАНИЕ ГЕНОМНЫХ БИБЛИОТЕК (ГЕНОТЕК) АДАПТАЦИЯ ГЕНА И СИНТЕЗ ЧУЖЕРОДНОГО БЕЛКА В E. coli ДОСТИЖЕНИЕ СВЕРХПРОДУКЦИИ БЕЛКОВ БАКТЕРИАЛЬНЫМИ ШТАММАМИ ВЕКТОРЫ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ КРУПНЫХ ФРАГМЕНТОВ ДНК Молекулярные векторы на основе бактериофага Космиды Искусственные бактериальные хромосомы Клонирующие векторы на основе нитевидных фагов Бифункциональные (челночные) векторы Искусственные хромосомы дрожжей ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ С ПОМОЩЬЮ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ СИСТЕМ Системы экспрессии дрожжей Системы экспрессии с использованием культур клеток насекомых Экспрессирующие системы на основе клеток млекопитающих КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ БАКТЕРИЙ И ПОЛУЧЕНИЕ ЦЕЛЕВОГО ПРОДУКТА БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

5 ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ А amp R ARS АТФ BAC bla BrCN Г ДНК ДГФР ИАК ИПТГ Ig A к ДНК lac Z ЛПС М мрнк his ori ori euk поли-а ррнк Р CEN Т tet R TRP Тт URA Х-гал Ц YAC YIp аденин ген резистентности к ампициллину сайт инициации репликации в клетках дрожжей аденозинтрифосфат искусственная бактериальная хромосома ген, кодирующий β-лактомазу бромциан гуанин дезоксирибонуклеиновая кислота дигидрофолатредуктаза 3-β-индолилакриловая кислота изопропил-β-d-тиогалактопиранозид иммуноглобулин А клонированная ДНК ген, кодирующий фермент β-галактозидазу липополисахарид метионин матричная рибонуклеиновая кислота гистидин сайт инициации репликации в геноме E. coli сайт инициации репликации в геноме эукариот полиаденилатная последовательность рибосомальная РНК промотор центромерная узнающая последовательность тимин ген резистентности к тетрациклину ген биосинтеза триптофана сайт терминации транскрипции ген биосинтеза урацила 5-бром-4-хлор-3-индолил--β-D-тиогалактопиранозид цитозин искусственная хромосома дрожжей интегративная плазмида дрожжей 6

6 ВВЕДЕНИЕ Эволюция биотехнологии происходила крайне неравномерно. Первый период растянулся на тысячелетия. В это время человек вел селекцию полезных для него животных и растений, эмпирически подбирал условия для быстрого получения вина, уксуса и кисломолочных продуктов (простокваши, кефира, сыра). Французский ученый Луи Пастер является основоположником научной биотехнологии. В классическом труде «Болезни вина и пива» (1865 г.) закладывается основной взгляд на природу брожения как результат активности бактериальных клеток, там же описывается возможность заражения исходных культур посторонней микрофлорой. Постепенно складывается общая картина представлений о чистой культуре микроорганизмов, способной продуцировать необходимые для человека метаболиты, и о важности поддержания чистоты культуры и создания среды для ее выделения и культивирования. Вводится понятие стерилизации. Проблема питательных сред для воспроизводства бактерий решил постоянный оппонент Пастера Роберт Кох. В 80-х годах XIX в. он предложил сначала метод культивирования бактерий на ломтиках картофеля, а несколько позже появляется прообраз современных агаризованных питательных сред. Важность этих работ особенно очевидна в наше время, поскольку применяемые в современной генной инженерии микроорганизмы, как и во времена Коха и Пастера, выращиваются на питательных средах, хотя требования к чистоте культуры в настоящее время несколько ужесточились. Этот период развития биотехнологии сужается до столетия, поскольку на смену ему приходит еще более короткий биотехнический период. Основной вехой биотехнического периода, безусловно, является возможность получения антибиотиков в промышленных масштабах. Открытие Александром Флемингом антибактериальной активности вторичного метаболита гриба Penicillium notatum (1929 г.), а также предложенные в 1933 г. А.Клюйвером и Л.Х.Ц. Перкиным технические приемы глубинного культивирования плесневых грибов позволили в короткие сроки наладить производство антибиотиков. С этого времени ведется постоянный поиск новых антибиотиков, совершенствуются методы их получения в промышленном масштабе. Не менее важными открытиями этого биотехнического века (даже менее чем века) является выявление функций ферментов и описание кинетики ферментативных реакций, технология культивирования клеток тканей растений (Г.Хаберланд, 1902) и животных (Т.Леб, 1897). Все открытия и достижения этого этапа чрезвычайно активно используются и в настоящее время. Эпоха генной инженерии началась с создания П. Бергом в 1972 г. первой рекомбинантной молекулы ДНК. Темп развития биотехнологии с приходом в ее практику генной инженерии ускоряется неимоверно, за период намного более короткий, чем в предыдущие этапы развития, нарабатываются основные приемы и методы получения генно-инженерной продукции. Уже имеющиеся достижения генной инженерии потрясают! Действительно, в продаже имеется человеческий инсулин, интерфероны, фактор некроза опухоли, интерлейкин -2, 7

7 соматотропин, соматомидин. Все эти препараты получены методами генной инженерии, а значит их аллоантигенная природа дает им возможность дольше оставаться в организме человека (уменьшается время их расщепления и полувыведения), оказывая лечебный эффект в тяжелых случаях гормональных нарушений (сахарный диабет и гипофизарная карликовость), при вирусных патологиях (гепатиты В и С) и злокачественных новообразованиях. Совершенствование метода получения препарата уменьшает их стоимость и увеличивает производительность. Достижения генной инженерии позволяют создавать принципиально новые способы диагностики врожденных патологий и ранней диагностики вирусной, злокачественной и соматической патологии с использованием ПЦР-диагностики (полимеразная цепная реакция) и ИФА (иммуноферментного анализа), в основе которого лежит использование моноклональных антител. Во всем мире развиваются технологии получения трансгенных растений. Введенные в генетически-модифицированные растения гены обеспечивают синтез новых белков, придающих устойчивость к болезням растений, насекомым-вредителям, гербицидам, позволяют улучшить агротехнические свойства сельскохозяйственных культур или добиться желаемых вкусовых качеств. Все это способствует решению продовольственных программ в развитых странах. За 10 лет, прошедших после внедрения в практику первого генетически-модифицированного растения, площади, занимаемые ими, достигли почти 60 млн гектар (6% от мировых сельхозугодий), а этот факт свидетельствует об экономической эффективности трансгенной агробиотехнологии. Помимо создания трансгенных организмов, глобальным направлением генетической инженерии является процесс биосинтеза необходимых аминокислот, сахаров, прежде всего для животноводства. Еще больше завораживают перспективы молекулярной биологии и генной инженерии. Вдохновленные успехами этих научных направлений многие коммерческие фирмы и правительственные программы (особенно в США) поддержали «Проект по изучению генома человека», что позволило сделать качественный скачек в картировании генома. До 1998 г. уровень развития биотехнологии был таков, что позволял секвенировать 100 тысяч пар оснований нуклеиновых кислот в день при стоимости 50 центов за основание, т.е. в год читали 36 млн. пар оснований. Развитие нанотехнологии дает возможность использовать ДНК-микрочипы, технология изготовления которых похожа на литографию, используемую при изготовлении интегральных схем. Эти зонды ускорили чтение генома и уже к середине 1999 года автоматизированные системы читали до 500 млн пар оснований в год, а себестоимость основания уменьшается до 25 центов. Такой прогресс привел к тому, что в настоящее время геном человека полностью прочитан. Уже секвенированы геномы: дрожжей, возбудителя малярии, дрозофилы, плоского червя, нескольких сот бактерий. Однако зачастую исследования такого рода носят коммерческий характер и находятся только в закрытых базах данных. Прочтение генома дает надежду на установление природы многих генетических заболеваний и первоначально точного прогнозирования, а 8

8 впоследствии целенаправленного вмешательства и корректировки данных патологий. Много надежд возлагают на прочтение генома геронтологи (геронтология наука о старении). Уже сейчас мы присутствуем при зарождении принципиально новой технологии нанотехнологии, которая получает признание и развивается еще более быстрыми темпами, чем генетическая инженерия. В рамках нанотехнологии созданы ДНК-биочипы для быстрой диагностики заболеваний, создаются принципиально новые системы для адресной доставки лекарственных препаратов, создаются матрицы для анализа белков, идут активные разработки в области проектировки и создания молекулярных компьютеров. Однако, как обычно, когда прогресс набирает высокие обороты, возникают сомнения в безопасности получаемой продукции и целесообразности использования предлагаемых методов. Особенно жестким нападкам подвергаются работы по клонированию и распространению генетически модифицированных продуктов. Далеко не все опасения связаны с научными результатами проводимых исследований, часть из них обращена к социальной сфере. Например, идентификация генома вызывает у американцев страх вторжения в частную жизнь. Для разрешения споров проводятся новые эксперименты и устанавливаются наблюдения за результатами опытов. Только такие многочисленные и объективные исследования дадут возможность определить правоту того или иного оппонента. Те, кого пугают отдаленные последствия «генетической революции», часто не учитывают скорости развития науки и ее возможностей. Тем не менее, уже имеющиеся достижения генетической инженерии пока явственно перевешивают и мнимые и реальные опасения. 9

9 1. ТЕХНОЛОГИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК Технология рекомбинантных ДНК на настоящий момент является основным методом, который расширил границы генетических исследований и положил начало генной инженерии. Благодаря ей можно получать необходимые белки с заданной структурой, устанавливать их функции, анализировать природу генетических заболеваний. Суть метода заключается в переносе генетического материала из одного организма в другой. Технология рекомбинантных ДНК позаимствовала набор методов из генетики микроорганизмов и впервые была продемонстрирована на бактериальной клетке хорошо известной кишечной палочке (E.coli). Единого, универсального набора методик по созданию рекомбинантной ДНК не существует, но чаще всего эксперименты проводят по следующей схеме (рис. 1.1): 1) из организма донора генов экстрагируют ДНК (клонируемую или чужеродную ДНК), подвергают ее ферментативному гидролизу и соединяют с другой ДНК, которую называют клонирующим вектором. В результате образуется новая рекомбинантная молекула; 2) эту конструкцию вводят в клетку-хозяина, в которой она реплицируется и передается потомкам. Процесс внедрения вектора в клетку-хозяина называется трансформацией; 3) производят отбор клеток, несущих рекомбинантную ДНК, т.е. трансформированных клеток. Процесс отбора называется селекцией трансформированных клонов; 4) получают специфический белковый продукт, синтезированный клетками-хозяевами. Его называют целевым белком, и после процедуры очистки используют по назначению. Однако перед практическим применением метода в биологии состоялся ряд революционных открытий Значение рестриктирующих эндонуклеаз для генетической инженерии Основные манипуляции с генами стали возможны только после открытия расщепления ДНК в местах строго определенных последовательностей рестриктирующими эндонуклеазами (рестриктазами). До этого делались попытки разрезать ДНК лазером, обработать ультразвуком, расплавить молекулу, разрезать ферментами ее одиночные нити и т.д. Однако при практической реализации методов оказывалось, что разрушение происходит в случайных, а не строго заданных участках нуклеотидов. Для того, чтобы произвести специфическое разрезание требовались строго определенные ферменты, способные это сделать. Первыми применили рестриктазы С. Коэн и Г. Бойер в 1972 г. В основу открытия легли работы с бактериофагом λ. Выясняя, почему фаг в одних штаммах кишечной палочки вызывает лизис (гибель) клеток, а в других не вызывает, ученые пришли к открытию двух видов ферментов: метилаз, модифицирующих ДНК, присоединяя к основанию метильную группу (CH 3 ), и рестриктаз. Метилазы размечают молекулу ДНК по строго специфическим участкам, предохраняя ее от разрезания эндонуклеазами. 10

10 Рестриктазы разрезают молекулу ДНК не случайным образом, а по строго заданным последовательностям нуклеотидов, при этом расщепляются обе комплементарные нити ДНК. Донорная ДНК Клонирующий вектор Нужная последовательность Ферментативное расщепление Ферментативная линеаризация Встраивание выделенного участка ДНК в вектор Рекомбинантная ДНК Введение рекомбинантной ДНК в клетку-хозяина и отбор клеток с клонированным геном Клетка-хозяин Белок Синтез белка, кодированного клонированным геном Рис Схема клонирования рекомбинантной ДНК 11

11 Изначально механизмы эволюции создали рестриктирующие эндонуклеазы для уничтожения чужеродной (прежде всего вирусной) нуклеиновой кислоты, которая попадает в клетку при инфицировании последней вирусными частицами. Отсюда и пошла этимология термина «рестриктазы», что означает «ограничение» размножения вируса. Было обнаружено два вида рестриктирующих эндонуклеаз: первый тип рестриктаз разрезает ДНК на тысячу пар оснований дальше от распознаваемой последовательности (от 400 до пар оснований дальше), поскольку ферменты такого типа атакуют только ДНК, скрученную в петлю. Петля образуется закручиванием в распознаваемом участке. Но поскольку размеры петли могут варьировать в широких пределах, а последовательность, в которой произойдет разрезание цепочек ДНК, заранее не известна, то I тип рестриктирующих эндонуклеаз не получил практического применения. Рестриктирующие эндонуклеазы II типа разрезают ДНК, как правило, по центру участка распознавания. А раз точное место разреза известно заранее, то эти ферменты можно использовать в генной инженерии. Интересной особенностью работы эндонуклеаз является то, что они обычно узнают участки ДНК, содержащие специфические палиндромные последовательности (т.е. последовательности перевертыши, которые читаются одинаково и от 3 к 5 концу и наоборот). Разные виды бактерий синтезируют разные рестриктазы, которые расщепляют молекулу ДНК в различных, специфичных для них участках. В настоящее время генетические инженеры манипулируют набором более чем из 200 эндонуклеаз. В табл. 1.1 приведены наиболее часто используемые в генетической инженерии эндонуклеазы. Таблица 1.1 Рестриктирующие эндонуклеазы, их продуценты и расщепляемые ими последовательности Наименование рестриктазы Сайт узнавания (расщепляемая последовательность) Бактерия, продуцирующая рестриктазу Характер образуемых концов Eco RI G A-A-T-T-C Escherichia coli RY 13 «Липкие» концы C-T-T-A-A G Bam HI G G-A-T-C-C Bacillus «Липкие» концы C -C-T-A-G G amyloliquefaciens Pst I C- T-G-C-A G Providencia stuartii 164 «Липкие» концы G A-C-G-T-C Sau 3AI G-A-T-C Staphylococcus aureus «Липкие» концы C-T-A-G Pvu II C-A-G C-T-G Proteus vulgaris «Тупые» концы G-T-A G-A-C Hpa I G-T-T A-A-C Haemophilus «Тупые» концы C-A-A T-T-G parainfluenzae Bgl II A G-A-T-C-T T- C-T-A-G A Bacillus globigii «Липкие» концы 12

12 Окончание табл Eco RII C-C-T-G-G Escherichia coli R 245 «Липкие» концы G-G-A-C-C Hind III A A-G-C-T-T Haemophilus influenzae «Липкие» концы T-T-C-G-A A Rd Hha I G-C-G C Haemophilus «Липкие» концы C G-C-G haemolyticus Taq I T C-G-A A-G-C T Thermus aquaticus YTI «Липкие» концы В названиях эндонуклеаз фигурируют наименования микроорганизма (первая заглавная буква название рода, последующие прописные вида бактерии), название штамма бактерии или ее серотипа и римской цифрой обозначается порядковый номер рестриктазы, выделенной из бактерий данного вида. Например, название рестриктазы Eco RI означает, что это первая эндонуклеаза, выделенная из Escherichia coli. Иногда приводится уточнение, к какому классу принадлежит данный фермент, в этом случае рестриктирующие эндонуклеазы обозначаются как R, а метилазы как М. Таблица показывает, что рестриктазы различаются не только по специфике разрезаемых последовательностей, но и по механизму действия. Возможны два варианта гидролиза: обе нити двойной спирали ДНК могут быть разрезаны в одном и том же месте. В этом случае образуются «тупые» концы. Но для практического использования в генетической инженерии такой способ разрезания не подходит, поэтому гораздо важнее эндонуклеазы, которые «режут» молекулу ДНК наискосок, когда нити нарезаются на перекрывающиеся последовательности «липкие» концы (рис. 1.2). 5 G T T A A C 3 3 C A A T T G 5 5 G T T A A C 3 3 C A A T T G 5 5 G G A T C C 3 3 C C T A G G 5 5 G G A T C C 3 3 C C T A G G 5 Рис Схема образования «тупых» и «липких» концов Рестриктазы расщепляют связь между атомом кислорода дезоксирибозы одного нуклеотида и фосфатной группой, присоединенной к атому углерода соседней дезоксирибозы. То есть при образовании «липких» концов получается, что длинный «хвост» разрезанной молекулы ДНК заканчивается 5 -фосфатной группой, а короткий «хвост» оканчивается 3 - гидроксильной группой. Эндонуклеазы обладают еще одной особенностью: некоторые из них узнают последовательности из четырех, некоторые из шести или из восьми пар нуклеотидов. Эту особенность используют для создания физической карты рестрикции ДНК. Для этого ДНК подвергают сначала обработке одним типом рестриктаз, затем другим или их комплексом. При этом при обработке одним типом рестриктаз получают смесь фрагментов ДНК разной длины, но с 13

13 одинаковыми «липкими» концами, при обработке набором из рестриктаз получают фрагменты молекулы, различающиеся как по длине, так и по характеру концов. Поученные фрагменты разделяют методом электрофореза в агарозе или полиакриламидном геле, сравнивают фрагменты молекул, полученные при раздельной рестрикции и при рестрикции смесью эндонуклеаз. На основе проведенного сравнения и составляются карты рестрикции. Например, нам нужно определить, как выглядит рестрикционная карта определенного фрагмента ДНК длиной 1650 пар нуклеотидов. Вначале мы обработаем заданный фрагмент ферментом Eco RI, затем берем в точности такой же целый фрагмент и обработаем рестриктазой Bam HI, а полученные «нарезки» разделим электрофоретически. Поскольку ДНК заряжена отрицательно, то фрагменты будут двигаться по направлению к катоду. Электрофорез обязательно проводится в растворе электролита. Легкие фрагменты движутся быстрее, так как они легче проходят через поры в агарозе, соответственно они располагаются на электрофореграмме дальше от начального места нанесения ДНК. Для идентификации нуклеиновой кислоты в агарозу добавляется этидиум бромид (красящее вещество, которое придает ДНК оранжевый цвет, заметный при освещении ультрафиолетом). Добавление красителя обязательно, поскольку и ДНК и агароза бесцветны. Eco RI Bam HI Eco RI + Bam HI Eco RI Eco RI Bam HI Bam HI Рис Пример картирования рестрикционных сайтов 14

14 На рис. 1.3 видно, что после обработки рестриктазами Eco RI и Bam HI нужная ДНК разделилась на три фрагмента, т.е. в этой ДНК есть две последовательности «G A-A-T-T-C», которые узнал и разрезал фермент Eco RI, и две последовательности «G G-A-T-C-C», которые являются сайтом рестрикции для Bam HI. Мы узнали, на какие по длине фрагменты рестриктазы делят заданную ДНК. Остается решить вопрос с взаиморасположением этих фрагментов относительно друг друга, т.е. составить карту рестрикции. Для этого нужно еще раз обработать заданную последовательность из 1650 пар нуклеотидов смесью рестриктаз Eco RI и Bam HI. Полученные данные электрофореза подвергаем анализу. Очевидно, что после обработки обеими рестриктазами вместе на электрофорезе исчезли полосы, соответствующие 850 пар нуклеотидов (п.н.) и 950 п.н., а значит, внутри этих фрагментов есть сайты узнавания и рестрикции для ферментов (соответственно длинный участок в 850 п.н., первоначально полученный от разрезания ферментом Eco RI, содержит внутри себя последовательность, узнаваемую Bam HI, а длинный фрагмент в 950 п.н. внутри себя несет последовательность, являющуюся сайтом рестрикции для Eco RI). Из предварительного анализа также следует, что никуда не исчезают фрагменты из 600, 300 и 100 п.н., а значит, внутри них нет сайтов распознавания для другого фермента. Участок в 300 п.н. должен располагаться посередине выбранного нами фрагмента ДНК, так как в противном случае он бы расщеплялся рестриктазой Bam HI. Таким образом, мы установили расположение фрагментов рестрикции для одной эндонуклеазы - Eco RI. Они располагаются, как показано на рис Как уже было отмечено, и последовательность в 500 п.н. и последовательность в 850 п.н. исчезают из электрофореграммы при сочетанном действии двух ферментов. Значит, внутри этих фрагментов имеются сайты для эндонуклеазы Bam HI. Понятно, что последовательность в 600 п.н., вырезаемая Bam HI, не может лежать внутри фрагмента в 500 п.н., образуемого Eco RI, так как она просто больше по размеру. Значит, составляя рестрикционную карту для Bam HI, мы должны отложить последовательность в 600 п.н. внутри рестрикционного фрагмента в 850 п.н. Остается только правильно расположить последовательности в 100 и 950 п.н. Последовательность в 100 п.н. не может располагаться сразу за последовательностью в 600 п.н., так как в противном случае внутри фрагмента в 500 п.н., образуемого рестриктазой Eco RI, не было бы сайта рестрикции, поскольку на его протяженность приходилась бы полностью последовательность в 950 п.н., а внутри фрагмента в 850 п.н. было бы сразу два сайта для Bam HI. Значит, единственно верное расположение фрагментов ДНК в рестрикционной карте: фрагменты в 100 и 600 п.н. по краям, а последовательность в 950 п.н. в центре. Нужно отметить, что нуклеотидные последовательности, узнаваемые рестриктазами, достаточно редкое явление, гораздо чаще встречаются четырехчленные участки узнавания. Подобные приведенному примеру рестрикционные карты чрезвычайно важны для клонирования ДНК и генной инженерии, поскольку они помогают локализовать ген, с которым в дальнейшем 15

15 будет вестись работа на четко определенном рестрикционном фрагменте. Кроме того, рестрикционные карты помогают в исследовании гомологии между родственными генами: если рестрикционные карты схожи, можно говорить о гомологии без применения полного секвенирования ДНК, которое и по настоящее время является еще достаточно дорогой процедурой. Следует отметить, что, несмотря на богатый набор рестриктаз, постоянно идет поиск новых ферментов. Главным их поставщиком, несомненно, являются прокариотические клетки бактерий, однако в настоящее время рестриктазы, обнаруживающие специфическую активность, найдены у Saccharomyces cerevisiae, Pichia membranafaciens, Chlamidomonas reinhardtii. После «специфического вырезания» необходимо правильно прочитать структуру гена. Проводится секвенирование ДНК, в ходе которого определяется последовательность нуклеотидов, кодирующих данный ген, а следовательно, можно сделать вывод о первичной структуре белка (последовательности аминокислот), синтезируемого на базе данного гена. Определяются и точные границы гена, кодирующего конкретный белок. При смешивании фрагментов рестрикции от двух разных ДНК между комплементарными липкими концами возникает спаривание, т.е. появляется новый фрагмент ДНК, представляющий собой комбинацию генов рекомбинантная ДНК. Однако при комплементарном узнавании возникают еще достаточно слабые связи, поэтому необходимо ликвидировать разрыв в сахарофосфатном остове. Это действие выполняется специфическими ферментами лигазами. Лигазы, используя энергию АТФ, катализируют образование фосфодиэфирных связей между концами спаренных полинуклеотидных цепей либо между «тупыми» концами отдельных фрагментов рестрикции. Помимо энергии АТФ, для работы лигаз требуется присутствие ионов Mg 2+. ДНК-лигазы бывают двух видов: один из них обнаружен в интактных клетках E. coli, другой индуцируется в E. coli при заражении ее бактериофагом Т4. У этих двух разновидностей лигаз разные потребности в кофакторах, кроме того, если первая из них способна катализировать только реакцию воссоединения «липких» концов, то ДНК-лигаза фага Т4 катализирует реакцию связывания «тупых» концов, т.е. по своему действию является более универсальной, а потому и чаще используется в генной инженерии. Одной из центральных задач генетической инженерии является клонирование выделенного гена, т.е. получение большого количества копий. Как известно, репликация, т.е. процесс удвоения ДНК, быстро идет в живой клетке Методы конструирования рекомбинантных ДНК Создавать гибридные (рекомбинантные) ДНК принято двумя основными методами: коннекторным и рестриктазно-лигазным. В 1972 г. один из основателей генетической инженерии П. Берг использовал именно 16

16 коннекторный метод. Принцип его прост на одном из «тупых» концов молекулы ДНК наращивается поли-а (полиаденилатная) последовательность, на «тупом» конце другой рекомбинируемой ДНК так же настраивается поли-т (политиминная) последовательность (рис. 1.4). А А А А А А А А Т Т Т Т Т Т Т Т Рис Схема образования поли-а и поли-т последовательностей на «тупых» концах рекомбинантной ДНК При смешивании ДНК, модифицированных таким образом, формируются кольцевые структуры, за счет того, что между поли-а и поли-т последовательностями образуются водородные связи. Наращивание полиаденилатных и политиминных последовательностей осуществляется за счет работы специального фермента концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы (терминальной трансферазы). Фермент работает только в присутствии кофакторов (двухвалентных ионов Mg или Со) и источника энергии АТФ. Поскольку при смешивании рекомбинируемых ДНК их объединение происходит самопроизвольно, то возможно образование одноцепочечных брешей в несколько нуклеотидов (рис. 1.5). Данные бреши застраиваются с помощью ДНК-полимеразы E. coli. Затем для упрочения ненадежных водородных связей рекомбинантные ДНК сшиваются лигазами. ДНК-полимераза ДНК-лигаза Рис Схема коннекторного метода Гибридная молекула ДНК Очевидным преимуществом данного метода создания рекомбинантной ДНК является возможность использования ДНК с «тупыми» концами, а такую ДНК легко получить не только благодаря использованию специфических ферментов (рестриктаз), но и механически разрушая ДНК (разрезание лазером и т.д.). Для достраивания повторяющихся последовательностей на концах ДНК используют комплементарные олигосахариды олиго (A) и олиго (T) концы или олиго (Г) и олиго (Ц) концы. Основным недостатком коннекторного метода является затруднение при выделении встроенного участка ДНК в том случае, если это необходимо. 17

17 Более простым в исполнении, а поэтому и наиболее популярным, является рестриктазно-лигазный метод построения гибридных ДНК. Впервые им воспользовался С. Коэн и сотрудники его лаборатории в 1973 г. Суть метода заключается в следующем: 1) одной и той же рестриктазой класса II специфически разрезают две молекулы ДНК, одну из которой требуется выделить заданный ген, вторую в которую этот ген будет впоследствии встроен. При этом фрагменты и той и другой ДНК будут иметь взаимокомплементарные «липкие» концы; 2) полученные фрагменты ДНК, гидролизованные одной и той же рестриктазой, смешивают. При этом липкие концы разных ДНК реассоциируют за счет комплементарного взаимодействия; 3) с помощью ДНК-лигазы ковалентно связывают реассоциированные фрагменты ДНК (рис. 1.6). ДНК, содержащая клонируемый ген Рестриктаза ДНК-лигаза Рестриктаза Рестриктаза Гибридная молекула ДНК ДНК векторной плазмиды Рис Схема рестриктазно-лигазного метода Сначала метод не получил такой большой популярности, которой он пользуется в настоящее время. Основная проблема заключалась в том, что не все необходимые гены лежат рядом с сайтами рестрикции для эндонуклеаз II класса. Преодолеть возникшее затруднение помогло развитие новой модификации метода, связанной с использованием линкерных молекул. Линкерами называют искусственно синтезированные фрагменты молекул ДНК, содержащие в своем составе последовательности, узнаваемые рестриктазами. Использование линкеров снимает все ограничения рестриктазно-лигазного метода и позволяет использовать его для создания практически любых гибридных ДНК. Модификация рестриктазно-лигазного метода с использованием линкерных молекул будет выглядеть следующим образом: 1) по «тупым» или «липким» концам фрагмента ДНК, который предполагается рекомбинировать с помощью лигазы фага Т4, 18

18 пришивают короткие синтетические двухцепочечные сегменты, имеющие участки узнавания для определенной рестриктазы; 2) после присоединения линкера его обрабатывают той рестриктазой, к которой он чувствителен, в результате образуются «липкие» концы; 3) в дальнейшем используется типичная схема рестриктазно-лигазного метода (рис. 1.7). Интересно, что можно определенным образом управлять теми продуктами, которые будут получены в результате реакции. Например, если смешивать рестриктазные фрагменты в высокой концентрации, будут образовываться преимущественно длинные линейные молекулы ДНК, а по мере снижения концентрации фрагментов повышается вероятность образования кольцевых молекул ДНК. Чаще всего образуются гибридные молекулы, состоящие из двух фрагментов. Как правило, образуется смесь разнообразных гибридных молекул ДНК, из которой целевые молекулы с требуемой структурой отбирают на стадии введения в клетку либо на стадии селекции и анализа гибридных клонов. Линкерная молекула + ДНК 1 ДНК 2 ДНК-лигаза Рестриктаза Рестриктаза ДНК-лигаза Рестриктаза Гибридная молекула ДНК Рис Схема использования линкерных молекул для конструирования гибридных ДНК 1.3. Применение векторов в генетической инженерии Клонирование рекомбинантной ДНК в клетке осуществляется благодаря ее доставке в клетку-мишень с помощью специальных носителей векторов. Теоретически любая молекула ДНК, реплицирующаяся внутри клетки, могла бы 19

19 использоваться в качестве вектора, но к векторам предъявляются особые требования: 1) вектор должен быть мелкой и управляемой молекулой ДНК; 2) внесение вектора в клетку не должно быть технически сложным; 3) метод производства и очистки вектора должен быть простым; 4) вектор должен иметь ограниченное количество сайтов рестрикции (в идеале только один для каждой рестриктазы); 5) он должен содержать генетический маркер, который впоследствии поможет в отборе клонов, несущих гибридные ДНК; 6) вектор не должен терять репликативные функции при встраивании чужеродного фрагмента ДНК. В наибольшей степени всем перечисленным требованиям удовлетворяют бактериальные плазмиды. Плазмиды это внехромосомные, автономно реплицирующиеся двухцепочечные кольцевые молекулы ДНК. Они есть практически в любой бактериальной клетке. Размеры плазмид варьируют от 1 т.п.н. до 500 т.п.н., т.е. полностью удовлетворяют требованию небольших размеров (как правило, в качестве вектора используются плазмиды, содержащие не более 15 т.п.н.). В каждой плазмиде есть сайт начала репликации (ori), без которого репликация невозможна, таким образом плазмиды полностью удовлетворяют требованию управляемости. Этот сайт может иметь разную степень специфичности, например, некоторые плазмиды способны реплицироваться только в строго определенных клетках одного бактериального вида или даже штамма, тогда как другие хорошо реплицируются в клетках, принадлежащих разным видам. Поскольку в настоящее время подробно описаны и исследованы три основных пути проникновения генетического материала в бактериальную клетку трансформация, трансдукция, конъюгация 1, то внесение вектора в бактериальную клетку также не представляет технических сложностей. Помимо плазмид, в качестве векторов используют некоторые вирусы, например, при создании рекомбинантной вакцины против гепатита в качестве вектора использован вирус коровьей оспы. Некоторые из плазмид представлены в клетке большим количеством копий (до 100), их называют высококопийными. Другие же находятся лишь в количестве 1 4 копий. Их называют низкокопийными. Естественно, для клонирования необходимо выбирать плазмиды, способные реплицироваться в большое количество копий. Поскольку среди плазмид естественного происхождения достаточно мало вариантов, удовлетворяющих всем требованиям к идеальному вектору, генноинженерным путем создаются рекомбинантные плазмидные векторы. 1 Трансформация процесс передачи фрагмента ДНК, выделенного клеткой-донором и поглощенного бактерией-реципиентом, при этом бактерия-реципиент приобретает новые свойства. Трансдукция процесс передачи генетической информации от одной бактериальной клетки к другой с помощью бактериофагов. Конъюгация образование конъюгативного мостика между двумя бактериальными клетками, по которому осуществляется перемещение генетического материала от донорной клетки к реципиентной. Коньюгативная перемычка формируется специальным видом пилей секс-пилями. 20

20 Во-первых, плазмида не должна быть разрушена рестриктазами при внесении в бактериальную клетку, поэтому в ней желательно присутствие только одного уникального сайта рестрикции, по которому впоследствии будет вставлен клонируемый ген. Этот участок для распознавания рестриктазой может находиться в любом районе вектора, кроме области, ответственной за начало репликации, иначе после встраивания чужеродной ДНК ori-сайт будет «испорчен» и вектор не сможет клонироваться в клетке-хозяине. Если плазмида первоначально содержит лишние рестриктазные участки, их убирают из вектора путем делеции 2. Однако для создания идеальной векторной плазмиды необходимо, чтобы она имела сайты узнавания для нескольких разнообразных рестриктаз. В таком случае она может использоваться для доставки самых разных вариантов генов, которые в свою очередь имеют разные рестрикционные сайты (т.е. одни из них выщепляются Bam HI, другие Eco RI и т.д., соответственно все сайты рестрикции для этих ферментов должны присутствовать на плазмиде). Поэтому в конструируемый векторный элемент вводят искусственно синтезированную ДНК (около 50 п.н.), содержащую участки для семи-восьми наиболее используемых рестриктаз (см. п. 1.2). Этот вводимый участок называют участком многократного клонирования или полилинкером. Во-вторых, плазмида должна содержать один или несколько маркерных (mark (англ.) выделять, обозначать) генов, которые придают клеткереципиенту новые признаки, позволяющие селективно выделять клетки с вектором из исходных клеток. Чаще всего в качестве маркеров для дальнейшей идентификации используют гены устойчивости к антибиотикам. Эти гены обычно обозначаются следующим образом amp R, что означает ген резистентности (resistance (англ.) - устойчивость) к ампициллину, или bla ген, кодирующий фермент β-лактамазу, расщепляющую β-лактамное кольцо пенициллина, tet R ген устойчивости к тетрациклину и т.д. Действительно, если взять бактериальную клетку, первоначально чувствительную к антибиотику, и, следовательно, не способную размножаться на среде, содержащей этот антибиотик, и попробовать трансформировать ее плазмидным вектором, содержащим amp R ген, то те из бактерий, которые поглотили данную плазмиду, будут беспрепятственно размножаться на среде с ампициллином, благодаря экспрессии amp R гена, защищающего бактерии от антибиотика. Те же бактерии, которые не трансформируются плазмидой, погибнут, так как не имеют соответствующего гена, а следовательно, и фермента, разрушающего антибиотик. Такие маркеры имеют множество преимуществ, например, всегда можно определить, не утратила ли еще бактериальная клетка вектор. Для этого просто высаживают клетки на среду с ампициллином. Пример генноинженерных плазмидных векторов представлен на рис После встраивания маркеров в векторы внедряют ген, который необходимо клонировать. Для этого рестриктированный участок, содержащий необходимый ген, вносят в векторную плазмиду. Плазмиду обрабатывают той же 2 Делеция это удаление одной или нескольких пар нуклеотидов. 21

21 рестриктазой, что и выделенный фрагмент ДНК, содержащий ген. Однако в данном процессе необходимо учитывать целый ряд моментов: во-первых, желательно выбирать такую рестриктазу, которая имеет только один сайт рестрикции на векторе, в противном случае плазмида будет разрезана на многочисленные фрагменты. Во-вторых, желательно, чтобы при комплементарном связывании «липких» концов вектора и клонируемой ДНК фрагмент ДНК встроился после ori сайта, инициирующего репликацию. Eco RI amp R Hind III Pst I pbr 322 Bam HI tet R Sal I ori-сайт Начало репликации Рис Генетическая карта плазмидного вектора рbr 322 После рестрикции плазмида теряет кольцевую форму и становится линейной молекулой с «липкими» концами. В систему добавляют клонируемую ДНК и начинаются процессы комплементарного узнавания и связывания «липких» концов: фрагмент ДНК вектор, вектор вектор, фрагмент ДНК фрагмент ДНК. Естественно, желательным из всех процессов является только образование рекомбинантной ДНК, т.е. соединение между векторной плазмидой и рестриктированным участком ДНК. Для закрепления связей молекулы обрабатывают ДНК-лигазой фага Т4 при обязательном присутствии молекул АТФ. В настоящее время все существующие клонирующие векторы можно классифицировать на три основных разновидности: амплифицирующие обеспечивают размножение (амплификацию) полученной рекомбинантной ДНК в клетке-хозяине; экспрессирующие наряду с размножением обеспечивают правильную и эффективную экспрессию чужеродных генов в клеткаххозяина, т.е. результатом работы таких векторов является синтез требуемого белка. Совершенствование экспрессирующих векторов позволяет создавать штаммы суперпродуценты необходимых белков; 22

22 интегративные при определенных условиях могут встраиваться в геном бактериальной клетки или вирусный геном. 2. ТРАНСФОРМАЦИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК Внесение рекомбинантной нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина называется трансформацией. Клетки, принимающие чужеродную ДНК и обеспечивающие ее репликацию, обозначаются как пермиссивные (чувствительные) клетки. Физиологическое состояние клетки, в котором она способна поглощать нуклеиновую кислоту из окружающей среды, называют ее компетентностью. Процесс естественной (природной) трансформации является достаточно редким событием, поэтому для процесса переноса плазмид внутрь клеток разработаны специальные приемы, в частности, клетки-реципиенты можно подвергать воздействию высоких температур, воздействию СаСl 2 и другим физическим и химическим методам воздействия на клетку. Эти факторы повышают проницаемость клеточной стенки, т.е. индуцируется компетентность клеток. Исторически первым методом, используемым для получения компетентных клеток для последующей трансформации, являлся ферментативный гидролиз. Ферментами разрушали клеточную стенку бактерий, после чего клетка превращалась в протопласт 3. Поскольку образующаяся структура чрезвычайно чувствительна к осмотическому шоку, ее необходимо было получать только в условиях изотоничности, т.е. окружающая среда должна была иметь такое же осмотическое давление, как и цитоплазма бактериальной клетки. Существует достаточно большой выбор ферментов, обеспечивающих расщепление клеточной стенки. Например, лизоцим знаменитый фермент, обнаруживаемый практически во всех живых организмах от вирусов (бактериофагов) до человека 4, разрушает пептидогликан грамположительных бактерий за счет гидролиза β-1,4-связей N-ацетилнейраминовой кислоты. Образуемые в результате гидролиза клеточной стенки протопласты и сферопласты становятся чувствительными к трансформации векторными плазмидами. Однако метод ферментативного гидролиза имеет ряд очевидных недостатков. В частности, достаточно трудоемко подбирать условия для эффективной регенерации разрушенных клеточных стенок. Процедуры получения протопластов и сферопластов, трансформация их молекулами ДНК, восстановление их клеточных стенок и отбор колоний являются многоэтапными и зависящими от целого ряда факторов. Поэтому на смену этому методу достаточно быстро 3 Протопласт бактериальная клетка полностью лишенная клеточной стенки и ограниченная только цитоплазматической мембраной. Вследствие этого имеет сферическую форму и высокую осмотическую чувствительность. Сферопласт бактериальная клетка с частично сохраненной клеточной стенкой и/или компонентами наружной мембраны. Осмотическая чувствительность и форма тела, как у протопласта. 4 У человека лизоцим относится к факторам неспецифической резистентности, обеспечивающей первую линию защиты от чужеродных агентов. Он обнаружен во многих физиологических жидкостях человека: слюне, слезах, носовой слизи, желудочном секрете, материнском молоке. 23

23 пришли более простые в исполнении. Например, метод обработки клеток растворами солей. Наиболее часто компетентность клеток индуцируют, применяя СаСl 2. Методика была разработана М. Манделем и А. Хигом, которые заметили, что обработка культуры бактериальных клеток раствором СаСl 2 на холоде с последующим тепловым шоком приводит к активной трансфекции бактериальными клетками добавленной в среду фаговой ДНК. Метод оказался очень простым в исполнении и воспроизводимым. Выяснилось, что наиболее эффективно компетентность индуцируется в активно делящихся клетках E.coli. Несколько сложнее происходит процесс трансформации бактериальных клеток векторными плазмидами. Частоту плазмидной трансформации повышают разными методами, например, подвергая смесь обработанных СаСl 2 клеток и ДНК тепловому шоку до (42 С), вводя в смесь моновалентные катионы, обрабатывая клетки органическими растворителями или сульфгидрильными реагентами, выращивая клетки на среде с повышенным содержанием Mg 2+ и т.д. Был выяснен и механизм индукции компетентности бактериальных клеток. Оказалось, что двухвалентные катионы (в особенности Са 2+ ) в условиях температурного шока способны вызвать фазовый переход липидов мембраны из обычного двухслойного состояния в необычное гексагональное (рис. 2.1). Этот фазовый переход сопровождается быстрым поглощением экзогенных (в том числе и векторных) молекул ДНК. Проникновение ДНК через внешнюю липополисахаридную (ЛПС) мембрану является наиболее сложным и именно он требует фазового перехода липидов мембраны, тогда как через цитоплазматическую мембрану E. сoli ДНК проникает абсолютно легко, без участия двухвалентных катионов и теплового шока. Нужно отметить, что фазовые переходы липидов внешней мембраны приводят к нарушению ее структуры, но не нарушают структуру цитоплазматической мембраны. Са 2+, t = 0 º C; затем тепловой шок t = 42 º C Обычная бислойная структура мембран Гексагональная структура Рис Фазовый переход липидов внешней мембраны, индуцированный ионами кальция и тепловым шоком Помимо физико-химических методов воздействия на бактериальную клетку, с целью увеличения проницаемости ее мембраны для плазмидной ДНК, широкое распространение получили и чисто физические методы, в частности в 1982 г. Т.Вонгом и Е. Нейман была разработана электропорация. Оказалось, что метод хорошо подходит для индукции компетентности как бактериальных, так и 24

24 эукариотических клеток. Суть его заключается в том, что кратковременное воздействие (5 20 мс) электрического поля высокой напряженности на клеточную мембрану приводит к образованию в ней пор. Это явление называют электропробоем. Поры имеют достаточно большой диаметр для прохождения через них векторных ДНК. В основном ДНК увлекаются в клетку осмотическими силами, возникающими при увеличении проницаемости мембраны. Клетка при этом набухает. Поэтому условия воздействия электрическим током нужно подбирать крайне аккуратно, учитывая напряженность электрического поля и продолжительность его действия, концентрацию трансформирующей ДНК и клеток-реципиентов. В оптимальных условиях электропорации количество трансформированных клеток может достигать 80% от всех выживших 5. Электропорирующий эффект высоковольтного разряда на липидную мембрану зависит от радиуса ее кривизны, поэтому для эффективного поглощения ДНК мелким бактериальным клеткам требуется большая напряженность электрического поля, чем крупным животным и растительным клеткам. Описанные выше методы хорошо отработаны и имеют высокую воспроизводимость, однако по-прежнему наряду с трансформацией прокариотических клеток используют другой метод конъюгацию, основанный на способности некоторых штаммов бактерий образовывать между клетками «конъюгативных мостиков». По этим мостикам плазмиды, ответственные за их образование, переходят из одной клетки (донора) в другую (реципиент). Такой способ переноса ДНК называется мобилизационным. Следует отметить, что конъюгация достаточно редкое явление среди бактериальных клеток, поэтому, как и трансформацию, ее индуцируют искусственно. Этот метод применяется очень редко, поскольку имеет низкую воспроизводимость и трудоемок. Для его реализации смешивают бактериальные штаммы трех видов: один вид содержит конъюгативную плазмиду, второй векторную плазмиду, содержащую гибридную ДНК, а третий представлен клетками-хозяевами, в которые, в конечном итоге, должен попасть вектор. Вначале конъюгативная плазмида индуцирует образование мостика с клетками, содержащими плазмидный вектор, и сама, обладая мобилизационными свойствами, переходит в эту клетку. Далее она вновь образует «конъюгативный мостик», но уже между клеткой-хозяином и клеткой, содержащей плазмидный вектор. По этому мостику вектор попадает к реципиенту (клетке-хозяину). Поскольку в этом методе для переноса плазмидной ДНК должна произойти конъюгация между тремя бактериальными штаммами, эта процедура получила название тройного скрещивания. 3. ОТБОР ГИБРИДНЫХ КЛОНОВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК При переносе генетического материала, после того, как ДНК попадет в клетку-хозяина и готова к репликации существует целый ряд трудностей. Вопервых, в бактериальной клетке-хозяине должны отсутствовать рестриктазы, 5 Поскольку наблюдается увеличение проницаемости мембраны, большинство клеток при проведении электропорации погибают. 25

25 сайты для узнавания которых находятся на векторной плазмиде (иначе векторная плазмида будет сразу разрушена). Во-вторых, плазмида не должна иметь способности встраиваться в хромосому (нуклеоид) бактериальной клетки (иначе возможен процесс гомологичной рекомбинации, кроссинговера и изменения первоначального гена, встроенного в плазмиду). Одной из самых важных задач, стоящих перед генными инженерами, является идентификация клеток, содержащих гибридную ДНК. Отбор клонов бактериальных клеток, содержащих целевые рекомбинантные ДНК, называется скринингом. Чаще всего используется фенотипическая селекция. Именно для ее осуществления и производят вставку в векторную плазмиду генов устойчивости к антибиотикам и антиметаболитам. Рассмотрим фенотипическую селекцию на примере отбора клонов, содержащих гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину. Один из сайтов рестрикции (например, для фермента Eco RI) располагается в пределах гена устойчивости к ампициллину. В этом случае появление гибридной ДНК будет сопровождаться встраиванием чужеродного фрагмента ДНК в вектор внутри гена устойчивости к ампициллину. То есть белок, обеспечивающий резистентность к этому антибиотику, не будет синтезироваться, а значит, клоны бактерий, содержащие гибридную молекулу, погибнут на среде с ампициллином. В то же время, если произошла трансформация другой, негибридной векторной плазмидой, в которой ген устойчивости к ампициллину сохранился в исходном состоянии, колонии будут выживать на среде с ампициллином. Таким образом, скрининг гибридных ДНК с использованием генов чувствительности к антибиотикам осуществляется в два шага. Первый высев на среду с тетрациклином: все трансформированные векторами бактерии выживают, все не трансформированные погибают. Второй высев на среду с ампициллином: все бактериальные клетки, содержащие гибридные молекулы, погибают, все не содержащие выживают (рис. 3.1). Для того, чтобы не «потерять» колонии, содержащие необходимые гибридные ДНК, пересев на среду с ампициллином осуществляется методом отпечатков. Для этого берут специальные бархотки, по диаметру соответствующие чашке Петри, аккуратно касаются ею поверхности среды с тетрациклином, при этом небольшое количество бактерий из каждой колонии переносится на бархотку, затем ею же касаются среды с ампициллином. Посевы на двух разных средах сравнивают: те из них, которые присутствуют на среде с тетрациклином и отсутствуют на среде с ампициллином, осторожно собирают и размножают именно они содержат искомый вектор с гибридной молекулой ДНК. Другим вариантом фенотипической селекции является использование векторных плазмид, несущих lac Z ген. Этот ген кодирует фермент β- галактозидазу, расщепляющий лактозу и ее аналоги. Обычно для селекции клонов в среду добавляют синтетический аналог, названный Х-гал. 6 Получается, что клетки, содержащие плазмиды с lac Z способны продуцировать 6 Х-гал это 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид. 26

26 фермент β-галактозидазу и отщеплять от Х-гал бромхлориндол краситель ярко-голубого цвета. Тогда колонии, образуемые этими бактериями, будут окрашены в голубой цвет. На особенностях цвета и основывается селекция клонов, содержащих векторные плазмиды. В начальный сегмент гена, кодирующего lac Z, встраивается короткий полилинкер с участками рестрикции для эндонуклеаз, такое внедрение не вредит гену lac Z и бактерия синтезирует β- галактозидазу. Если же участок встраивания в начале гена большой (это происходит при внесении рекомбинантной ДНК), то lac Z перестает работать, а значит бактерия уже не может продуцировать β-галактозидазу и колонии не окрашиваются они выглядят бесцветными. Таким образом, в данном случае скрининг можно осуществить за один шаг. Для этого векторная плазмида должна содержать ген устойчивости к какому-либо антибиотику (например, ампициллину) и lac Z. С вектором проводят стандартные манипуляции, а затем анализируют результаты трансформации, высевая бактерии на среду, содержащую ампициллин и Х-гал. На этой среде выживут исключительно бактерии, трансформированные вектором, остальные, не имея гена устойчивости к ампициллину, погибнут. tet R рекомбинация amp R tet R amp R Трансформации нет cайт для Eco RI Трансформация вставка фрагмента чужеродной ДНК E. coli E. coli E. coli СРЕДА С ТЕТРАЦИКЛИНОМ Гибель Переносят на среду с ампициллином Рис Селекция бактериальных клонов с использованием генов устойчивости к антибиотикам 27 Гибель

27 Из выросших на среде колоний остается отобрать те, которые содержат гибридную ДНК. Сделать это просто: если колония бесцветная, значит ее клетки содержат вставку в виде фрагмента чужеродной ДНК, если окрашена в голубой цвет значит lac Z ген не пострадал и бактерии поглотили нерекомбинантный вектор. Бесцветные колонии отсаживают на другую среду и продолжают работать с ними (рис.3.2). рекомбинация Трансформации нет сайт рестрикции для PvuII Вставка фрагмента чужеродной ДНК и нарушение функционирования lac Z E.coli Трансформация E. coli E. coli Среда с ампициллином и X-гал Гибель клеток Синие колонии, значит lac Z-оперон не нарушен, а E.coli трансформирована не рекомбинантной плазмидой Бесцветные колонии, значит E. coli трансформирована рекомбинантной плазмидой Размножение (клонирование) Рис Селекция бактериальных клонов с использованием генов устойчивости к антибиотику и lac Z 28

28 Основным недостатком метода фенотипической селекции клонов, содержащих гибридные ДНК, является то, что нет ответа на вопрос: какой конкретно гибридной ДНК трансформирован данный клон. А основной задачей данного этапа является именно выявление последовательностей специфической рекомбинантной ДНК. Чтобы решить этот вопрос, существует другой метод метод гибридизации нуклеиновых кислот in situ (в тканях). Для этого метода основным условием является использование радиоактивно меченого зонда 7. Принципиальными этапами метода гибридизации нуклеиновых кислот являются следующие: 1) колонии бактерий, трансформированные векторными плазмидами и селективно отобранные, как было описано выше, методом отпечатков переносят на нитроцеллюлозный фильтр; 2) фильтр помещают на питательный агар и инкубируют до появления на нем колоний бактериальных клеток. При этом расположение колоний на чашках с фильтром будет соответствовать тому, что наблюдается на первоначальных матричных чашках Петри (в этом и заключается суть метода отпечатков); 3) выросшие на фильтре бактерии лизируют в жестких условиях, добиваясь одновременно гибели бактериальных клеток и денатурации ДНК. Для этого клетки обрабатывают 0,5 н NaOH, затем быстро нейтрализуют. Такая обработка приводит к денатурации ДНК, в этом состоянии молекула крепче связывается нитроцеллюлозой. Чтобы связь стала необратимой, фильтр прогревают при 80 С; 4) фильтр с денатурированной ДНК обрабатывают радиоактивно мечеными зондами ДНК или РНК, имеющими последовательность, комплементарную тому гену, который необходимо выявить. Гибридизацию с зондом проводят при несколько повышенной температуре и в течение достаточно длительного времени. При этих условиях происходит ренатурация, т.е. комплементарное связывание между одноцепочечной ДНК, закрепленной на нитроцеллюлозном фильтре, и зондом. Для эффективной гибридизации и образования стабильного комплекса необходимо, чтобы совпало не менее 80 нуклеотидных пар; 5) фильтр активно отмывают от избытка зонда, чтобы убрать посторонний радиоактивный фон; 6) производят радиоавтографию осуществляют экспозицию нитроцеллюлозного фильтра, на котором комплементарно связались радиоактивно меченые зонды с рентгеновской пленкой, после чего пленку проявляют. Засвеченные участки на пленке соответствуют тем гибридным ДНК, которые и являлись искомыми, следовательно, для дальнейшего накопления полученных трансформированных клеток необходимо будет отсевать те колонии с матричных чашек Петри, 7 Обычно радиоактивно меченные зонды представляют собой молекулу ДНК или РНК (от 100 до 1000 п.н.), меченую радиоактивным фосфором 32 Р 29

29 соответствующие по положению участкам гибридизации на нитроцеллюлозном фильтре, т.е. участкам засветки на рентгеновской пленке. Часть выросшей культуры каждого клона помещают на хранение в глицерине при температуре - 70 С, а из остальной части выделяют плазмидную ДНК и подвергают ее дальнейшему анализу. Полная схема метода гибридизации нуклеиновых кислот представлена на рис Матричная чашка Петри Нитроцеллюлозный фильтр Селективно отобранные колонии Перепечатка колоний на фильтр + Хранение при 4 С Чашка Петри с агаром Инкубация при 37 С Колонии вырастают на фильтре Фильтр снимают с агара Отобранный клон 1. Лизис колоний 2. Денатурация ДНК 3. Гибридизация с 32 Р РНК 4. Радиоавтография Рентгеновская пленка Выделение и анализ плазмид Рис Схема метода гибридизации нуклеиновых кислот in situ Еще одним методом отбора гибридных клонов является функциональная комплементация. Этот метод имеет преимущества перед фенотипической селекцией: позволяет сразу оценить не только сам факт трансформации рекомбинантного вектора в бактериальную клетку, но и определить, насколько активно экспрессируется ген, внесенный в бактерию. Рассмотрим функциональную комплементацию на примере. Возьмем дикий штамм E. coli, 30

30 подвергнем его селективному отбору и добьемся появления мутации, в результате которой штамм станет ауксотрофным 8 по какой-либо аминокислоте (например, по гистидину). Будем поддерживать данный штамм на среде, содержащей гистидин. В векторную молекулу путем рекомбинации встроим фрагмент хромосомы дрожжевых клеток. В этом фрагменте находится ген, ответственный за синтез гистидина. Произведем трансформацию бактериальных клеток этим вектором по одному из описанных выше методов. Высеем трансформированную E. coli на среду без гистидина. Ген дрожжей в этом случае комплементирует, т.е. дополняет мутацию по гистидину, восполняя геном кишечной палочки, поэтому, чем активнее E. coli будет расти на среде без гистидина, тем, следовательно, активнее экспрессируется бактериальной клеткой рекомбинантный ген. Этот метод имеет ряд очевидных преимуществ, но, к сожалению, не всегда пригоден, поскольку чаще всего векторы рекомбинируют генами эукариотических клеток или вирусов, поскольку функциональное выражение генома эукариот принципиально отличается от прокариотических клеток, а у вирусов вообще отсутствует метаболическая активность и метод функциональной комплементации неприменим. В данном случае функциональную экспрессию рекомбинантных генов оценивают методом радиоимммуноанализа белков in situ. Метод радиоиммуноанализа позволяет оценить не только сам факт трансформации бактериальных клеток векторами, но и выраженность экспрессии белка, кодируемого рекомбинантными генами. Метод основан на иммунохимии, точнее, самой распространенной в иммунологии реакции специфического узнавания и связывания антигена и антитела. В результате этого образуется иммунный комплекс. Если либо антиген, либо антитело первоначально содержит ту или иную метку, то иммунный комплекс можно легко выявить 9 (рис. 3.4). + = Антитела на подложке Меченые антигены Меченые иммунные комплексы Рис Схема выявления антител с помощью меченых антигенов 8 Ауксотроф микроорганизм, утративший в результате мутаций способность самостоятельно синтезировать тот или иной метаболит. Такие штаммы могут расти только на специальных средах, куда этот метаболит добавлен. 9 В качестве метки обычно используются либо флюоресцентные красители (в этом случае наличие иммунных комплексов определяют под люминесцентным микроскопом), либо фермент (тогда для идентификации иммунного комплекса в реакционную среду добавляют субстрат), либо радиоактивный изотоп (тогда используют радиоавтографию для выявления иммунных комплексов). 31

31 Практически все белки достаточно легко связываются с полистеролом или поливинилом. Эти материалы используют в качестве сорбентов для антител (иммуноглобулинов). В остальном принцип метода тот же, что гибридизация нуклеиновых кислот in situ. Вначале колонии трансформированных бактериальных клеток методом отпечатков переносят на чашки Петри и выращивают при оптимальных условиях. Затем полученные колонии бактерий лизируют, подбирая условия лизиса таким образом, чтобы не вызвать денатурации белка (как бактериального, так и синтезированного рекомбинантного). К поверхности с лизированными бактериями прижимают полистероловый (или поливиниловый) диск, на который предварительно были адсорбированы антитела против рекомбинантного белка. Если бактериальная клетка активно экспрессировала рекомбинантный белок, то он специфически свяжется с антителами. Произойдет образование иммунного комплекса. Чтобы выявить иммунные комплексы, используют еще один набор антител, на этот раз меченых изотопами. Данный метод получил название «сендвич-метода», поскольку получается многослойная структура. Часть меченых антител может неспецифически связаться с полистеролом, или рекомбинантными белками. Поэтому перед тем как проводить анализ полистероловый диск тщательно отмывают. Обычно в качестве метки для антител используют 125 I. Эти метки выявляются радиоавтографически. Там, где идет засветка на радиопленке, присутствует радиоактивный йод, а значит, образовался иммунный комплекс с рекомбинантным белком. Следовательно, колонии, соответствующие этим меткам, не только трансформированы векторными плазмидами, но и ведут активный синтез рекомбинантного белка. Производят отсев таких колоний с матричных чашек и анализ содержащихся в них гибридных плазмид. 4. СОЗДАНИЕ ГЕНОМНЫХ БИБЛИОТЕК (ГЕНОТЕК) Клетки всегда трансформируют таким образом, чтобы в одну бактерию попал только один вектор. Универсальной задачей генной инженерии является создание библиотеки генов. Под библиотекой генов (генотекой) понимают набор одинаковых векторов, в которые встроены фрагменты хромосом некоего организма (например, мыши), в совокупности представляющие весь геном этого организма. Процесс создания библиотек также называют процессом разделения геномной ДНК на клонируемые элементы и введение этих элементов в клетки-хозяева. При создании генотек прокариотических и эукариотических организмов будет наблюдаться определенная специфика, связанная с тем, что у прокариот кодирующие структуры каждого гена непрерывны, тогда как у эукариот кодирующие области (экзоны) разделены некодирующими (интронами). Общий принцип создания геномных библиотек заключается в следующем: 1) с помощью рестриктазы проводят частичный гидролиз фрагмента ДНК (или хромосомы); 2) полученные участки встраивают в генно-инженерный вектор (плазмидный или фаговый); 32

32 3) полученными векторами трансформируют (производят трансфекцию в случае использования в качестве вектора фага) бактериальные клетки, добиваясь, чтобы в каждую бактериальную клетку попало не больше одного вектора; 4) производят типичный скрининг клонов бактериальных клеток, отбирая те из них, куда попал полноценный ген, кодирующий один из белков организма, для которого создают генотеку. Рассмотрим представленную схему подробнее. Например, возьмем одну из хромосом мыши (выделить ее можно из любой соматической клетки) и начнем обрабатывать ее рестриктазой, добиваясь лишь частичного гидролиза ДНК 10. Почему частичный гидролиз является принципиальным при создании библиотеки генов? Предположим необходимый нам ген (например, ген, кодирующий пероксидазу) расположен на ДНК таким образом, что рестриктаза (например, Sau 3AI) разрежет его на два фрагмента. В этом случае два фрагмента одного гена попадут в разные векторы, а следовательно, нельзя будет добиться синтеза полноценного белка одним клоном бактериальных клеток (рис. 4.1, б) Искомый ген Внесение рестриктазы Sau 3AI (а) (б) (в) (г) (д) Рис Схема полного и частичного гидролиза ДНК рестриктазой Sau 3AI: а схема расположения участков рестрикции для фермента Sau 3AI (указаны стрелками); б полный гидролиз ДНК при длительной экспозиции и высокой концентрации фермента по всем трем сайтам рестрикции; в, г частичная рестрикция ДНК по одному сайту, при которой искомый ген (закрашен серым) оказывается не затронутым; д частичная рестрикция по двум сайтам, при которой искомый ген оказывается поврежден, а значит, в дальнейшем функционировать не будет Другая ситуация наблюдается в случае частичной рестрикции. Из рис. 4.1, в, г следует, что частичный гидролиз осуществляет разрезание фрагмента 10 Глубину гидролиза можно контролировать изменением времени инкубации или количества фермента. 33

33 ДНК лишь в одном месте. При этом участок искомого гена оказывается целым и неповрежденным. А значит, при встраивании в векторную плазмиду участка 1-2 (рис. 4.1, в) или (рис. 4.1, г) ген полностью окажется в векторе, будет трансформирован в клетку-хозяина, и в этой клетке будет наблюдаться его полноценная экспрессия. Одной из самых больших проблем, возникающих на данном этапе, является то, что некоторые сайты рестрикции могут оказаться слишком крупными для клонирования. Вместе с тем, каждый вектор (см. п. 1.3) имеет лишь ограниченную емкость для включения чужеродной (рекомбинантной) ДНК. Например, вектор на основе бактериофага λ позволяет встроить порядка 14 тыс. п.н. чужеродной ДНК. Эту проблему решают, используя другую рестриктазу. Поскольку при разрезании ДНК даже одной рестриктазой образуется большое количество фрагментов ДНК, этот метод иногда называют методом «дробовика» (или шотган-клонированием). Процедуры встраивания полученных фрагментов ДНК и трансформации бактериальных клеток производят, как описано в п.п. 1.2 и 2. В последующем важным этапом на пути создания библиотеки генов является поиск бактериальных клонов, несущих гены (искомые гены) или смысловые (экзонные) последовательности ДНК, кодирующие белки. Для этой цели используют методы гибридизации нуклеиновых кислот in situ или радиоиммуноанализ белков in situ, описанные в п. 4. При использовании метода гибридизации нуклеиновых кислот радиоактивно меченые зонды обычно получают одним из двух методов: либо используют клонированную ДНК близкородственного организма (гетерологичный зонд), либо методом химического синтеза, основываясь на известной аминокислотной последовательности искомого белка 11. Метод гибридизации может дать позитивный результат и в том случае, если ген, кодирующий искомый белок, представлен в данном фрагменте ДНК не полностью. Поэтому обычно для создания библиотеки этот метод дополняют использованием электрофореза и картирования, позволяющих идентифицировать фрагменты с перекрывающимися последовательностями. Или проводят секвенирование рестрикционного фрагмента, чтобы убедиться, что ген содержит и старт- и стопкодон и полноразмерный ген, кодирующий белок. Чтобы повысить вероятность присутствия в библиотеке полной версии искомого гена, обычно прибегают к использованию фрагмента ДНК, заведомо большего размера, чем средний размер прокариотического гена. Еще одним вариантом скрининга трансформированных клонов является селекция по активности белка. Этот метод хорошо подходит в том случае, если вставленная в вектор рекомбинантная ДНК кодирует фермент, 11 И тот, и другой метод имеют ряд недостатков. В случае гибридизации гетерологичным зондом нужно помнить, что между ДНК-зондом и ДНК-мишенью может наблюдаться низкий процент гомологии, и тогда не будет происходить полноценной гибридизации. В то же время использование только химически синтезированных зондов останавливает вырожденность генетического кода, т.е. одна аминокислота может быть закодирована несколькими вариантами триплетов, например, глицин может кодироваться GGU, GGC, GGA, GGG. В этом случае также может произойти лишь частичное комплементарное узнавание между зондом и мишенью. 34

34 не синтезируемый изначально клеткой-хозяином. Именно таким образом были отобраны для библиотек трансформаты, несущие гены α-амилазы, эндоглюканазы, β-галактозидазы. Принцип селекции в этом случае прост. На питательную среду, в состав которой входит субстрат для предполагаемого фермента, добавляют краситель и засевают бактериальные клетки, трансформированные векторными плазмидами. В том случае, если плазмида несет полноценный ген, кодирующий фермент, на питательной среде в присутствии субстрата индуцируется экспрессия этого гена и фермент начинает утилизировать субстрат. В результате процесса ферментации часть красителя оказывается в колонии, следовательно, окрашенные колонии несут векторы с геном, кодирующим фермент. Иногда для селекции клонов очень выгодно использовать метод функциональной комплементации (п. 4). Именно таким образом были выявлены гены, ответственные за синтез ряда важных антибиотиков и формирование азотофиксирующих клубеньков на корнях растений. Если для встраивания в векторы прокариотических генов необходимо использовать лишь рестриктазы и лигазы, то в случае рекомбинации эукариотических генов процесс несколько усложняется. Нельзя встроить произвольный фрагмент эукариотической ДНК в вектор и дожидаться синтеза полноценного белка бактериальной клеткой. Этому процессу помешают несколько причин. Во-первых, эукариотичекий геном содержит экзонные (смысловые) и интронные (вставочные) последовательности, при транскрипции и те и другие переносятся на РНК. В эукариотической клетке перед трансляцией происходит сплайсинг, то есть из мрнк специальными ферментами вырезаются все интронные последовательности. Если ДНК находится в бактериальной клетке, то первый этап транскрипция осуществится без каких-либо проблем, а вот этапа сплайсинга не будет, так как у бактерий нет ферментативного аппарата, обеспечивающего этот процесс. Во-вторых, важным этапом посттранскрипционной модификации эукариотической мрнк является ее метилирование, пришивание к ней кэпа и полиаденилатного хвоста. Естественно, все эти процессы не будут происходить в бактериальной клетке. Значит, традиционный процесс встраивания вырезанного рестриктазами фрагмента эукариотической ДНК в вектор производить нельзя. В этом случае используют кднк. Иногда даже для обозначения различий между библиотекой прокариот и эукариот используют разные наименования. Библиотеку прокариот называют библиотекой геномной ДНК, а эукариот библиотекой кднк. Процесс получения комплементарной ДНК копии, или кднк из клеток эукариот включает в себя несколько стадий: 1) на первой стадии из клетки эукариота извлекают мрнк; 2) далее с помощью специального фермента получают копию с мрнк комплементарную ДНК; 3) на основе одноцепочечной ДНК с помощью ДНК-полимеразы получают двухцепочечную ДНК; 4) полученные ДНК встраивают в плазмидные векторы, которые в последствии клонируют; 35

35 5) получают клоны кднк, а вся совокупность клонов, происходящих из одного препарата мрнк, составляет библиотеку кднк. Рассмотрим первые три стадии подробнее. Как правило, исходную мрнк берут из тех клеток, которые активно экспрессируют данный белок. Например, при необходимости создания библиотеки глобина мрнк будет извлечена из эритроцитов, поскольку именно они в основном синтезируют гемоглобин. Для выделения белка клетки, как правило, вначале дезинтегрируют (для разрушения клеточных мембран животных клеток достаточно применения гомогенизаторов). Клеточные структуры разделяют центрифугированием, с помощью диализа освобождают от малых молекул, а затем последовательно используют разные методы фракционирования: хроматографию (адсорбционную, распределительную, ионообменную, фронтальную ионообменную, аффинную и т.д.) и гель-фильтрацию. В последнее время начали активно развиваться методы витального (прижизненного) извлечения мрнк из клетки. Например, с помощью сканирующего зондового микроскопа из клетки локально извлекается мрнк, а затем получают критическую массу этого необходимого белка с помощью полимеразной цепной реакции. Обычно получение мрнк из клеток, в которых уровень экспрессии интересующего гена высок, не представляет больших технических сложностей. Однако в том случае, если белок является минорным, т.е. экспрессируется незначительно, требуются методы обогащения содержания смеси молекул мрнк необходимым видом. Для этого используют ряд методов. Если имеются антитела к интересующему белку, то их используют для избирательного осаждения полирибосом, на которых этот белок и синтезируется. Выделенные полирибосомы содержат мрнк, участки вновь синтезированного белка и рибосомы, из этого комплекса выделяют только мрнк, которую используют для дальнейшего синтеза к ДНК. Таким способом преципитат может быть обогащен необходимой мрнк в раз. Любая мрнк на 3 -конце имеет полиаденилатную последовательность. Эта последовательность не закодирована в ДНК, а присоединяется к мрнк в ходе посттранскрипционной модификации с помощью специального фермента 3 -терминальной полинуклеотидтрансферразы. Благодаря этой поли-а последовательности мрнк можно отделить от других белков клетки, в том числе и от других видов РНК (рибосомальной и транспортной), составляющих более 90% суммарной РНК клетки. Для разделения фракцию РНК пропускают через колонку с целлюлозой с пришитыми к ней полимерами из тимидиловых поли Т-остатков. Матричные РНК комплементарно связываются с носителем за счет поли-а остатков, а не имеющие таких фрагментов рибосомальные и транспортные РНК остаются в растворе. Колонку тщательно промывают, а затем комплементарные связи разрушают нагреванием или изменением рн. На основе выделенной мрнк синтезируют к ДНК. Для этого используют уникальный фермент ретровирусов 12 обратную транскриптазу (фермент также называют ревертазой, или РНК-зависимой ДНК-полимеразой). Для синтеза 12 Название ретроврусы отражает тот факт, что в их жизненном цикле встречается процесс обратный нормальной транскрипции, т.е. вместо обычного для всех живых организмов синтеза РНК на базе ДНК у ретровирусов синтезируется ДНК на базе ДНК. Процесс этот является уникальным и ни у одного живого существа, кроме ретровирусов не встречается. К ретровирусам относятся ВИЧ-вирус, а также некоторые онковирусы, в т.ч. вирус саркомы Рауса. 36

36 кднк вначале синтезируют олиго нуклеотидную (олиго-т) затравку, затем в систему вносят олиго-т, м РНК и обратную транскриптазу и полный набор нуклеотидов, после чего олиго-(т) затравка гибридизуется с поли-а концом мрнк и обратная транскриптаза начинает синтезировать ДНК, комплементарную мрнк. Интересной особенностью при работе ревертазы является то, что на конце растущей цепи кднк образуется шпилька (рис. 4.2). мрнк АААААА 3 Ревертаза, нуклеотиды Т Т Т Т Т олиго (Т)-затравка мрнк 3 3 к ДНК Гидролиз РНК - цепи РНКазой Н + ДНК-зависимая ДНК-полимераза 5 Нуклеаза S к ДНК Рис Схема получения к ДНК с помощью ревертазы Затем, по окончании синтеза, мрнк разрушают (для этой цели, как правило, используется фермент РНКаза Н) и с помощью обычной ДНК-зависимой ДНКполимеразы на основе полученной одноцепочечной ДНК синтезируют двухцепочечную. В качестве затравки ДНК-полимераза использует образованную на конце однонитевой к ДНК шпильку. Чтобы получить двухцепочечную ДНК без связи между цепями, необходимо разрушить шпильку. Для ее вырезания используют фермент нуклеазу S1. При этом небольшая часть к ДНК будет потеряна. Из очень небольшого количества мрнк можно получить большое количество кднк, для этого к кднк пришивают линкерные фрагменты, встраивают в векторы и клонируют. Все последующие стадии создания библиотеки и выявление необходимых клонов принципиально не отличаются от поиска нужных клонов для библиотек прокариот. То есть так же применяются методы гибридизации нуклеиновых кислот in situ или радиоиммуноанализ белков in situ, или используют селекцию по активности белка. 37

37 После клонирования одного из генов можно, постепенно анализируя хромосому, картировать его местоположение и идентифицировать местоположение соседних генов. Этот метод получил название «прогулка по хромосоме». Принцип его работы заключается в следующем: один и тот же фрагмент ДНК разрезается двумя разными рестриктазами (например, рестриктазами Pvu II и Hind III), затем уже клонированный ген превращают в радиоактивный зонд, пришивая к нему изотоп 32 Р. Если этот уже клонированный ген оказался в рестриктазной библиотеке Pvu II, то с его помощью осуществляют скрининг перекрывающихся последовательностей в библиотеке Hind III (рис. 4.3). Одинаковые последовательности комплементарно свяжутся (так как это участки одной и той же ДНК), что будет выявлено за счет радиоактивной метки. После этого можно добиться распаривания оснований и уже только что идентифицированный фрагмент из библиотеки Hind III, пришив к нему радиоактивную метку, использовать в качестве зонда. Его новь используют для поиска перекрывающихся последовательностей в библиотеке Pvu II и т.д. Таким образом, идентифицируя ген за геном, можно постепенно продвигаться по хромосоме каждый раз на расстояние приблизительно 300 тыс. п.н. и более. Этот метод не только позволяет картировать в хромосомах весь набор крупных геномных клонов, но и выявить мутации в определенных генных фрагментах. Для этого, используя иммуноблоттинг, сравнивают фрагменты генома здорового организма и организма, в котором предположительно произошла мутация. Уже клонированный ген Фрагменты, на которые разрезает участок ДНК рестриктаза Pvu II Искомый ген Фрагменты, на которые разрезает участок ДНК рестриктаза Hind III Библиотека от рестриктазы Pvu II Фрагмент I Библиотека от рестриктазы Hind III Фрагмент IV Фрагмент II Фрагмент V Фрагмент III В результате сопоставления перекрывающихся последовательностей получаем исходную хромосомную карту с точным картированием искомого гена. 38

38 Фрагмент I Фрагмент IV Фрагмент II Фрагмент V Искомый ген Рис Картирование искомого гена методом «прогулки по хромосоме» 5. АДАПТАЦИЯ ГЕНА И СИНТЕЗ ЧУЖЕРОДНОГО БЕЛКА В E. coli Синтез чужеродного белка бактериальными клетками (прежде всего E. coli), т.е. экспрессия чужеродных генов, ограничивается целым рядом препятствий. Прежде всего, процессы транскрипции (переписывания информации с ДНК на мрнк), трансляции (синтеза белка рибосомами на основе мрнк), а также транспорта белка через мембрану клетки у прокариот и эукариот имеют разные сигналы и существенно различаются. Одной из наиболее важных проблем является сохранность вновь синтезируемого белка внутри бактериальной клетки. Поскольку бактерии, как и другие организмы, стремясь поддержать внутриклеточный гомеостаз, набором протеаз разрушают чужеродные белки, попадающие в них. Кроме того, многие белки эукариот претерпевают посттрансляционную модификацию, выражающуюся в гликозилировании некоторых фрагментов (или всей) белковой последовательности. Гликозилирование в значительной степени может изменять как активность белка, так и его транспорт внутри клетки. Проблема посттрансляционной модификации является наиболее сложной разрешимой, так как у бактерий отсутствует этот процесс, а следовательно, и нет набора необходимых для него ферментов. Однако многие генно-инженерные белки, продуцируемые клетками E. coli, могут работать и без гликозилирования. Примером таких белков являются интерфероны. Если же посттрансляционная модификация белка является принципиальной для обеспечения полноценной активности секретируемого белка, то имеет смысл вводить векторы не в бактериальные, а в эукариотические клетки-хозяева. Гораздо проще решается вопрос о разности в транскрипционных и трансляционных сигналов прокариотических и эукариотических клеток. Чаще всего, чтобы обеспечить полноценную экспрессию чужеродного гена его сшивают с каким-либо собственным геном бактериальной клетки. В этом случае пришитый ген использует все промоторные последовательности и 39

39 активационные сигналы родного гена. Обычно в качестве родного гена-носителя используют β-галактозидазу. Например, для синтеза соматостатина 13 необходимо к последовательности кодирующего его гена (эта последовательность состоит из 42 нуклеотидов) пришить линкерные участки и в начало гена добавить триплет ТАС (он кодирует аминокислоту метионин). Синтезированный таким образом ген соматостатина встраивают в плазмидный вектор таким образом, чтобы он оказался сразу после гена β-галактозидазы (рис. 5.1). Ген β-галактозидазы, предварительно встроенный в вектор, содержит все необходимые промоторные и активаторные последовательности, поэтому после трансформации вектором клеток E. coli происходит экспрессия рекомбинантной ДНК и синтезируется химерный полипептид, т.е. гибридный полипептид, состоящий из двух белков (в данном случае из β-галактозидазы и соматостатина). После выделения этого полипептида остается решить только одну принципиальную задачу выделить из химерного белка активный соматостатин. Она решается очень просто: к белку добавляют химическое соединение бромциан (BrCN), который расщепляет белки по метионину. Эта аминокислота содержится только в β- галактозидазе, а также использовалась в качестве связующего звена между двумя белками. В соматостатине такой аминокислоты нет, поэтому бромциан расщепит β-галактозидазу, а соматостатин останется неповрежденным. Дополнительным преимуществом использования этого способа является легкость в последующем скрининге трансформированных штаммов бактерий, которые можно отбирать методом фенотипической селекции, используя среду с добавлением Х-гал (метод подробно описан в п. 4). Помимо lac Z гена, кодирующего β-галактозидазу, в качестве родного гена-носителя можно брать ген, кодирующий фермент люцеферин-люциферазу. При трансформации бактерий этим геном они приобретают собственную люминесцентную активность, так как люцеферин-люцефераза обладает сильным свечением в присутствии АТФ. В настоящее время используется не только такой способ, так как необходимо помнить об ограничении объема вносимой в вектор генетической информации. Поэтому в конструируемых сейчас векторах, как правило, от родного гена оставляют только все сигнальные последовательности и последовательности, кодирующие несколько первых аминокислотных остатков (с N-конца белка). В этом случае белок не требуется выделять из химеры, так как эти несколько аминокислот на активность продуцируемого белка не влияют. 13 Соматостатин гормон роста, используемый для лечения гипофизарной карликовости у детей. 40

40 Промотор Ген β-галактозидазы РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА Линкер Ген соматостатина, перед которым встроена последовательность ТАС Трансформация клеток E. coli ДНК E. coli Рекомбинантные плазмиды Экспрессия химерного белка M et M et M et M et - аминокислота метионин Обработка бромцианом M et M et Фрагменты β-галактозидазы M et Соматостатин Рис Схема получения человеческого гормона соматостатина в клетках E. coli Еще одной проблемой является то, что значительная часть белка, синтезируемого бактериальной клеткой, остается в периплазматическом пространстве, во внешней (липополисахаридной) или внутренней (плазматической) мембранах клетки. Успешность выделения вновь синтезируемого белка из цитоплазмы зависит от специальных коротких последовательностей на N-концевом участке белка. Эти последовательности получили название сигнальных пептидов. Сигнальные пептиды гидрофобны и 41

41 имеют небольшой положительный заряд. Именно эти свойства и обусловливают их связывание со специфичными участками на внутренней мембране бактерий. То есть благодаря сигнальным пептидам обеспечивается, в конечном итоге, секреция белка в периплазматическое пространство грамотрицательной E. coli. В периплазматическом пространстве сигнальные пептидазы отщепляют сигнальный пептид, и белок приобретает окончательный вид. Помимо секреции, сигнальные пептиды выполняют еще одну чрезвычайно важную функцию защиту синтезируемого белка от протеолиза в цитоплазме бактериальной клетки. Многочисленные исследования показали, что механизм секреции через мембраны сходен у всех типов прокариотических и эукакриотических клеток. Секретированные в периплазматическое пространство белки выделяют в процессе легкого осмотического шока, которому бактерии подвергают после ферментативного разрушения пептидогликанового слоя клеточной стенки. Очистка секретируемого рекомбинантного белка, как правило, не является проблематичной, так как в периплазматичееском пространстве содержится очень небольшое количество собственного белка бактериальной клетки. Крайне редко белок способен экскретироваться (выделяться) из бактериальной клетки во внешнюю среду. В этом случае, помимо сигнального пептида, он содержит С-концевой домен. Сигнальный пептид, как это было описано ранее, формирует комплекс с определенным участком цитоплазматической мембраны и способствует синтезу белка в периплазматическое пространство, где отщепляется сигнальными пептидазами. После этого С-концевой домен-помощник формирует пору во внешней (ЛПС) мембране бактерии, т.е. он является белком-порином. Через формируемую пору белок экскретируется из бактериальной клетки. После выхода рекомбинантного белка из бактериальной клетки (такой синтез отмечен только для ферментов) С- концевой домен-помощник отщепляется в результате автопротеолиза. После отщепления фрагментов, обеспечивающих прохождение через мембраны, белок приобретает свою окончательную, функционально активную форму. Пока не удалось добиться экскреции бактериями в окружающую среду чужеродных высокомолекулярных полипептидов эукариотических клеток. Как правило, и эукариотические пре-белки и химерные белки обнаруживаются в периплазматическом пространстве бактерий. Специально сконструированные векторные системы позволяют получать в периплазматическом пространстве такие белки, как нуклеаза и рибонуклеаза бактерий, а также человеческие соматостатин и интерферон. Многочисленные исследования показали, что экскреция белков бактериальной клеткой определяется не только наличием сигнальных пептидов, но и в значительной степени структурой белка. В настоящее время идет активный поиск и конструирование векторных плазмид, которые модифицируют структуру белка и проницаемость бактериальной клетки таким образом, чтобы обеспечить максимальный выход экскретируемого белка из клетки. Значительным успехом в этой области стало создание биореактора, в котором клетки E. coli иммобилизованы на силиконовом носителе и эффективно продуцируют и экскретируют из клеток α-амилазу. 42

42 6. ДОСТИЖЕНИЕ СВЕРХПРОДУКЦИИ БЕЛКОВ БАКТЕРИАЛЬНЫМИ ШТАММАМИ Одной из основных задач генной инженерии является конструирование высокопродуктивных бактериальных штаммов, активно синтезирующих белки и другие биологически активные соединения. Эту задачу удается разрешить, соблюдая ряд условий: 1) для клонирования используют мультикопийные векторы, поскольку в этом случае ген присутствует в высокой дозе, а значит, будет обеспечиваться высокий уровень его экспрессии; 2) клонируемая последовательность гена должна располагаться под контролем промотора, который хорошо узнается РНК-полимеразой клетки; 3) переписываемая с гена мрнк должна обладать высокой стабильностью, не разрушаться бактериальными ферментами и хорошо транслироваться на рибосомах бактерии; 4) белок, синтезируемый в бактериальной клетке, сам должен обладать высокой стабильностью и не разрушаться бактериальными протеазами. Первое условие называют эффектом дозы гена: увеличение в геноме количества копий гена вызывает пропорциональное повышение уровня его белкового продукта. В генетической инженерии этот эффект достаточно легко достигается благодаря использованию мультикопийных плазмид. Для создания мультикопийных векторов используют плазмиды с ослабленным контролем репликации. Такие плазмиды могут воспроизводить в бактериальной клетке в среднем около 60 своих копий. Использование в качестве мультикопийного вектора рbr 322, описанного в п. 1.3, увеличивает уровень синтеза белка в раз, это означает, что копийность вектора рbr 322 выше средних значений. Значительного увеличения копий векторных плазмид можно достигнуть, обрабатывая клетку хлорамфениколом. В этом случае число копий плазмид возрастает до молекул на клетку (это почти половина всей ДНК клетки!). К сожалению, такой способ увеличения копийности не применим в генноинженерной практике, поскольку хлорамфеникол является ингибитором белкового синтеза, не дающим клетке продуцировать белок в полном объеме. Гораздо более перспективно использовать плазмиды, в которых репликация является термочувствительным процессом. Существуют мутантные плазмиды, обладающие способностью к безудержной репликации при температуре выше 35 С. При этом за 2 3 ч количество копий вектора в клетке достигает 75% всей клеточной ДНК. Большим преимуществом таких плазмид является то, что синтез белка в данном случаен не ингибируется и использование таких плазмид приводит к сверхпродукции требуемого рекомбинантного белка. Например, синтез некоторых ферментов возрастает в раз. Созданы плазмиды, в которых промотор находится под репрессирующим контролем термочувствительного белка. Для того, чтобы снять контроль репрессора, необходимо поднять температуру до 42 С. В этом случае белок-репрессор инактивируется, промотор 43

43 вновь становится активным, что приводит неконтролируемой репликации плазмиды. Параллельно с амплификацией (увеличением числа копий) плазмиды происходит и сверхсинтез кодируемых ею белков. Синтез белка превосходит синтез дикими типами бактерий более чем в 100 раз. Особенностью этих термоиндуцированных плазмид является то, что в результате их интенсивной репликации клетки E. coli погибают. Как правило, это происходит уже тогда, когда основная задача сверхсинтез белка уже выполнена. В этом случае жизнеспособность бактериальных клеток уже не важна. Таким образом, применение мультикопийных векторов позволяет во многих случаях добиваться высокого уровня экспрессии бактериальной клеткой белковых продуктов рекомбинантной ДНК. Но многие сегменты человеческой ДНК не могут быть клонированы в таких векторах, поскольку детерминируемые ими белки при достижении сверхпродукции необратимо нарушают важные физиологические процессы в бактериальной клетке. Такие гены приходится клонировать в низкокопийных векторах, либо использовать мультикопийные векторы, но со строгим регулированием процесса репликации. Вторым условием, влияющим на уровень экспрессии белка, является эффективность процесса транскрипции требуемого гена. Транскрипция в бактериальной клетке осуществляется РНК-полимеразой. Количество этого фермента в клетке E. coli около 3 тыс. молекул. Каждая молекула состоит из четырех субъединиц. Одна из субъединиц обеспечивает строго специфическое связывание с участками ДНК, с которых начнется процесс транскрипции. Эти последовательности на ДНК называются промоторами. РНК-полимераза закрывает промоторный участок ДНК, после достаточно прочного связывания происходит локальное расплетение цепей, и фермент начинает синтез нити РНК на соответствующем одноцепочечном участке ДНК. Многие гены диких типов E. coli контролируются относительно слабыми промоторами. Поэтому в генетической инженерии при конструировании векторных плазмид перед генами, экспрессию которых нужно получить, встраивают сильные промоторы. Таким образом удается увеличить продукцию требуемого белка в 50 раз. Еще более перспективным направлением является использование промоторов, которые можно регулировать. Это особенно необходимо тогда, когда закодированный в векторе белок токсичен для клеток E. coli. В этом случае на промоторе находится белок-репрессор, который не дает РНК-полимеразе связаться с промоторной последовательностью и начать транскрипцию. Бактериальную массу наращивают до необходимых значений, после чего тем или иным способом (например, воздействием высокой температурой) инактивируют репрессор. В этом случае препятствие для воздействия РНК-полимеразы с промотором снимается. Такой подход позволяет вырастить клетки, содержащие рекомбинантные ДНК до высокого титра, и лишь после этого инициировать продукцию белка, сверхсинтез которого приведет к гибели бактериальных клеток. Кроме наращивания бактериальной биомассы, задержка транскрипции выполняет еще одну важную функцию. Известно, что интенсивная транскрипция, индуцируемая сильным промотором, способствует подавлению репликации плазмид, что постепенно приводит к 44

44 удалению последних из бактериальной клетки. Помимо термочувствительных используют также промоторы, индуцируемые низкомолекулярными соединениями 14. Однако рассматриваемые методы регуляции транскрипции обладают и некоторыми недостатками. Например, при повышении температуры среды индуцируется не только экспрессия целевого гена, но и некоторых генов клеткихозяина. Особенно нежелательно, когда активируются гены, кодирующие бактериальные протеазы, разрушающие вновь синтезируемый целевой белок. Использование химических индукторов в значительной степени удорожает биотехнологический процесс. Избежать этих недостатков помогает использование полимераз бактериальных вирусов бактериофагов. Оказалось, что РНК-полимераза бактериофагов достаточно просто устроена (в отличие от бактериальной, она состоит лишь из одной субъединицы), узнает более короткую последовательность промотора, прочнее, чем бактериальная РНКполимераза, связывается с промотором и скорость ее работы в 5 раз превышает скорость РНК-полимеразы E. coli. Для того, чтобы фаговая РНК-полимераза начала транскрипцию с рекомбинантной ДНК в вектор, перед целевым геном встраивают специальный промотор для этого фермента. После этого можно просто инфицировать клетки E. coli фаговыми частицами. Бактериальный вирус, проникнув в клетку, использует ее ферменты для транскрипции своих мрнк, а с синтезированных мрнк идет трансляция вирусного белка. РНК-полимераза относится к ранним вирусным белкам 15, поэтому синтезируется в первую очередь. Однако в случае инфицирования бактериофагами клеток E. coli содержание фаговых РНКполимераз оказывается очень низким (лишь 0,1 % всего клеточного белка). Поэтому процесс создания штаммов E. coli, суперпродуцентов белка является двустадийным. Вначале E. coli трансформируют векторной плазмидой, в которой находится ген фаговой РНК-полимеразы. РНК-полимераза бактериальной клетки связывается с промотором и начинает считывание мрнк с этого гена. После этого уровень продукции фаговой РНК-полимеразы в бактериальной клетке возрастает в десятки раз. Этот процесс никак не влияет на жизнедеятельность бактерий. Затем в E. coli вводят еще одну совместимую векторную плазмиду, которая содержит целевой ген и перед ним промотор для фаговой РНК-полимеразы. Уже синтезированная предварительно в бактериальной клетке РНК-полимераза бактериофага связывается со своим промотором и начинает процесс транскрипции целевых мрнк столь интенсивно, что вызывает гибель бактериальных клеток, поскольку быстро расходует рибонуклеозидтрифосфаты клетки. При этом процесс транскрипции происходит настолько сильно, что считывается не только мрнк с целевого гена, 14 Например, снять репрессию с промотора можно 3-β-индолилакриловой кислотой (ИАК) или изопропил-β-dтиогалактопиранозид (ИПТГ). 15 Вирусные белки принято подразделять на ранние и поздние. К ранним относятся регуляторные белки, обеспечивающие процессы транскрипции, трансляции и репликации вируса в клетке-хозяине. Поздние гены кодируют структурные белки вириона, из которых впоследствии будет состоять капсид вируса. Белки суперкапсида также кодируются поздними генами. У некоторых вирусов (к ним относятся, например, герпесвирусы) выделяют еще и сверхранние гены. 45

45 но и полностью вся генетическая информация, закодированная на плазмиде. Поэтому важным моментом является внесение на плазмиду после целевого гена сильного терминатора транскрипции. Создание таких генетических конструкций приводит к увеличению синтеза целевого белка до % суммарного клеточного белка. Третьим условием создания суперпродуцентов белка является повышение эффективности трансляции уже синтезированных м РНК. Время жизни м РНК в бактериальной клетке небольшое порядка 4 мин, но процесс трансляции организован очень эффективно. Действительно РНК-полимераза еще считывает информацию с гена, а на конце образованной м РНК уже присоединяются рибосомы, синтезирующие полипептидную цепь со скоростью аминокислотных остатков в секунду. Окончание трансляции соответствует кодонам UAA, UAG, UGA. Они называются терминальными. С ними в составе рибосом взаимодействует особый белок фактор высвобождения, который обеспечивает отделение полипептидной цепи и распад рибосомального комплекса. В отличие от эукариот, бактериальные мрнк могут значительно различаться по количеству кодируемых ими белков. Молекулы мрнк, кодирующие только один белок и соответствующие одному гену, называют моноцистронными, кодирующие несколько белков полицистронные. В полицистронных мрнк реализуется принцип независимого связывания рибосомальных комплексов на разных участках мрнк, т.е. каждый цистрон имеет собственный участок связывания рибосом. Естественно, что для достижения суперпродукции белка выгоднее использовать полицистронные конструкции. Кроме того, на эффективность трансляции в значительной степени влияют последовательности нуклеотидов мрнк в участке связывания с рибосомами, однако строго определенных закономерностей установить не удалось, поэтому каждый раз оптимальные последовательности определяются экспериментальным путем. В плазмидах используют как природные, так и синтетические последовательности, кодирующие участки связывания для рибосом. Таким образом все три стратегии размножение целевого гена в многокопийных векторах, контроль их сильными промоторами и включение оптимальных участков для связывания рибосом позволяют достигать необычайно высокого уровня трансляции белка бактериальными клетками. Все эти процедуры обеспечивают увеличение синтеза белка, но не гарантируют его сохранности. В бактериальной клетке чужеродные мрнк и белки могут подвергаться быстрой деградации клеточными ферментами. Период полужизни различных мрнк в бактериальных клетках может различаться в 50 раз. Оказалось, что на стабильность молекул, прежде всего, влияют их 3' и 5' области: наличие шпилек на 3'-конце после терминации и определенная структура 5'-области значительно увеличивают период полужизни молекул. Обычно генные инженеры изучают структуру стабильных мрнк с длительным периодом полужизни и используют эти природные заготовки при конструировании векторов. Много сил направлено на создание мутантных штаммов E. coli, в которых нарушены системы ферментной деградации 46

46 чужеродного белка и РНК-аз. В таких штаммах удается добиться 50 кратного увеличения выхода целевого белка. Особенно выгодно создавать такие мутантные штаммы, где объединены мутантные локусы РНК-аз и протеаз. Протеолитические ферменты E. coli могут локализоваться в цитоплазме, периплазматическом пространстве и в мембране. Соответственно они могут представлять опасность для разных классов целевых белков, локализованных в той или иной области. Значительное влияние на активность протеаз оказывают условия культивирования бактерий и состав питательных сред. Протеолиз значительно возрастает при дефиците аминокислот, фосфатов, сульфатов, аммония. Протеазы существенно нарастают в клетке при повышении температуры культивирования. Заингибировать образование протеаз можно ионами Zn 2+, поэтому после внесения Zn 2+ в питательную среду наблюдается увеличение синтеза белка. Заражение бактериальной культуры некоторыми бактериофагами также приводит к ингибированию протеаз и увеличению продукции чужеродных белков. Поскольку в периплазматическом пространстве протеаз меньше, чем в цитоплазме, белки, имеющие сигнальные пептиды и способные проникать в периплазматическое пространство, имеют преимущество в создании для них штаммов-суперпродуцентов. Еще одной стратегией повышения стабильности белка является создание высокомолекулярных белков, состоящих из нескольких тандемных повторений целевого пептида (или белка). В клетках E. coli при высоком уровне продукции как прокариотических, так и эукариотических белков, превышающем 20% суммарного клеточного белка, в цитоплазме часто образуются тельца-включения нерастворимые агрегаты. Эти гранулы могут содержать не только целевой белок, но и небольшое количество примесей (белки клетки, ррнк, плазмидную ДНК). Существуют методы выделения агрегатов и высвобождения из них целевого белка. 7. ВЕКТОРЫ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ КРУПНЫХ ФРАГМЕНТОВ ДНК 7.1. Молекулярные векторы на основе бактериофага Ранее рассмотренные плазмидные векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК длиной порядка 10 тыс. п.н., но задача создания генотек требует внесения в векторы более крупных фрагментов. Поэтому возникли системы, отличные от плазмидных векторов. Одной из таких систем является использование бактериофага λ, паразитирующего на клетках E. coli, для доставки рекомбинантной ДНК. Помимо него, часто используют близкородственные лямбоидные фаги. Бактериофаг во внутриклеточной стадии жизненного цикла может реализовать одну из двух стратегий: литическую либо лизогенную. В первом случае бактериофаг впрыскивает свою нуклеиновую кислоту внутрь бактериальной клетки, где нуклеиновая кислота реплицируется, затем происходит транскрипция и трансляция фаговых белков, самосборка новых фаговых частиц, разрыв (лизис) бактериальной клетки (приблизительно 47

47 через 20 мин после начала жизненного цикла вируса) и выход около 100 новых бактериофагальных вирусов в окружающее пространство. Затем заражение новых бактерий и повторение литического цикла. При изогенном варианте развития внесенная в бактеральную клетку ДНК фага не реплицируется, а остается в бактериальной клетке. Чаще всего в этом случае наблюдается встраивание ДНК вируса в ДНК бактериальной клетки. Такое явление получило название интегративная лизогения, а нуклеиновая кислота бактериофага, интегрированная в бактериальный белок, обозначается как профаг. Существование профага внутри бактериальной клетки может быть достаточно длительным. В этом случае нуклеиновая кислота реплицируется совместно с ДНК клетки-хозяина. При изменении условий жизнедеятельности бактериальных клеток (как правило, это ухудшение условий культивирования, недостаток питательных веществ и т.д.) бактериофаг меняет лизогенную стратегию на литическую, вирусные частицы начинают размножаться и уничтожать бактериальные клетки-хозяева. При изучении ДНК бактериофага λ оказалось, что она состоит из 50 тыс. пар нуклеотидов, 20 тыс. пар из которых ответственны за интеграцию в геном бактериальной клетки. То есть эти 20 тыс. пар нуклеотидов без ущерба для литического цикла вируса можно заменить фрагментом любой другой ДНК, приблизительно эквивалентной по размеру убираемому участку, и таким образом создать векторную фаговую систему. Фаговая ДНК может находиться в двух состояниях: внутри головки бактериофага она линейная и на концах у нее находятся одноцепочечные хвосты (это «липкие» концы). При попадании фаговой ДНК в клетку-мишень «липкие» концы соединяются, и ДНК приобретает кольцевую форму. На протяжении молекулы имеется два сайта для рестриктазы Bam HI, разрезающей ДНК на три фрагмента, центральный фрагмент заменяют целевым участком рекомбинантной ДНК. Помимо этого на ДНК бактериофага есть пять участков для рестриктазы Eco RI, три из которых находятся в центральной области, не существенной для литического цикла развития фага, а следовательно, по ним также можно вставлять фрагмент ДНК, кодирующий целевой белок. Вставляемый фрагмент должен иметь протяженность 20 тыс. пар нуклеотидов, чтобы суммарная протяженность вектора составила 50 тыс. пар нуклеотидов. Более длительная последовательность (52 тыс. пар) не сможет упаковаться в головку фага, а значит, не будет эффективной системы доставки. Недопустима и слишком короткая последовательность. Если векторная ДНК будет заключать в себе менее 38 тыс. пар нуклеотидов, то сформируется неинфекционная фаговая частица, неспособная заражать клетку E. coli. Таким образом оптимальная длина рекомбинантной ДНК для фага λ составляет тыс. пар нуклеотидов. Рекомбинантный фаг λ размножают только на мутантах E. coli, которые не обеспечивают размножения дикого типа бактериофага λ. Создав и выделив рекомбинантные бактериофаги λ, их популяцию тщательно поддерживают, периодически пересевая на свежую культуру E. coli. Скрининг фаговых частиц отличается от скрининга трансформированных бактерий. Дело в том, что созревшие полноценные фаговые частицы разрывают бактериальные клетки. 48

48 Поэтому на сплошном газоне, засеянном культурой E. coli, появляются бляшки или зоны лизиса участки прозрачного агара. В бляшке находятся, таким образом, фрагменты разрушенных клеток E. coli, фаговые частицы и свободная ДНК бактериофага. Поэтому для скрининга и создания библиотеки, необходимо перенести зоны лизиса на нитроцеллюлозный фильтр. Дальнейший анализ будет зависеть от того, какой компонент является искомым. Если идет поиск рекомбинантной ДНК, то фильтр вначале обрабатывают 0,5 н NaOH, затем быстро нейтрализуют щелочь и прогревают фильтр до 80 С. Эти режимы способствуют денатурации ДНК (ее расплетанию и формированию одноцепочечной нити) и ее прочному закреплению на фильтре. Далее скрининг основывается на применении ДНК-зондов, меченых радиоактивными или ферментными метками, как это было описано в п. 4. Если искомым компонентом являются целевые белки, то используют иммунологические методы, и в отпечатках бляшек, антителами, мечеными радиоактивно или ферментами, находят целевой белок. Сопоставив пятна на фильтре, дающие положительную реакцию, с бляшками на исходной чашке, отбирают позитивные бляшки (содержащие требуемую последовательность ДНК или целевой белок) и проводят субкультивирование. Субкультуры служат источником рекомбинантных бактериофагов, которые по отдельности культивируют в E. coli Космиды Космиды это плазмидные векторы, в которых встроен участок генома фага λ, обеспечивающий возможность их упаковки в фаговую частицу. Таким образом, этот вектор объединяет в себе преимущества фагового и плазмидного вектора. Он способен включать и активно переносить в бактериальную клетку участки чужеродной ДНК до 40 тыс. пар нуклеотидов. При этом космиды без затруднений реплицируются внутри клеток E. coli. Каждая космида имеет oriсайт, т.е. точку начала репликации, которая обеспечивает существование космиды внутри E. coli в виде плазмиды и ген устойчивости к антибиотику, облегчающий селекцию штаммов, трансформированных рекомбинатным космидным вектором. Наиболее часто применяемая сконструированная космида plfr-5 состоит из приблизительно 6 тыс. пар нуклеотидов, которые представлены двумя cos-сайтами бактериофага λ, обеспечивающими упаковку космиды в головку бактериофага, для удобства они разделены сайтом рестрикции для Sca I. При разрезании этой рестриктазой космида приобретает линейную форму с двумя «липкими» концами. Помимо двух cos-сайтов, oriсайта и гена устойчивости к тетрациклину в состав космиды входит полилинкер с шестью уникальными сайтами рестрикции (HindIII, PstI, SalI, BamHI, SmaI, EcoRI). Создание вектора протекает в несколько стадий: вначале фрагменты ДНК, предназначенные для клонирования, разрезают рестриктазой BamHI и очищают центрифугированием. Затем той же рестриктазой гидролизуют космиду. В смеси космидной и клонируемой ДНК (при этом космидная ДНК должна находиться в 49

49 избытке) происходит лигирование, т.е. соединение «липких» концов этих двух ДНК. Далее необходимо перевести космидный вектор в линейную форму. Для этого его обрабатывают рестриктазой Sca I. Сos-сайты разъединяются, т.е. образуется типичная фаговая ДНК с двумя «липкими» концами. Полученные векторы легко упаковываются в капсидную головку бактериофага λ. При проведении лигирования возможна реассоциация космид между собой. Однако получаются слишком короткие фрагменты ДНК (только 6 тыс. пар нуклеотидов), которые не могут упаковываться в фаговые частицы. Фагами, содержащими векторы, инфицируют культуру E. coli. В бактериальной клетке космида быстро переходит в кольцевую форму, т.е. «липкие» концы cos-сайтов быстро спариваются. Это наиболее стабильная конфигурация ДНК, которая длительное время поддерживается внутри бактериальной клетки и реплицируется, поскольку в состав космиды входят все необходимые для этого компоненты. Скрининг штаммов, содержащих рекомбинантную космиду, не представляет труда, поскольку на космиде находится ген устойчивости к антибиотику, поэтому на среде с тетрациклином выживут только колонии, внутри которых есть космида. Общая схема клонирования с помощью космидного вектора представлена на рис Космиды имеют большое преимущество перед плазмидами при создании геномных библиотек: в них можно встраивать более протяженные фрагменты ДНК, а значит, для создания геномной библиотеки требуется меньшее число клонов и меньшее время на их скрининг. Однако в том случае, если участки встраиваемой ДНК порядка 20 тыс. п.н., предпочтение отдают фаговым векторам, поскольку оказалось, что проводить скрининг бляшек проще и быстрее, чем колоний бактериальных клеток. Кроме того, клонированные фрагменты в составе фага более стабильны. А в целом векторные фаги λ и космиды составляют взаимодополняющую группу векторов, пригодных для формирования библиотек и энциклопедий генов Искусственные бактериальные хромосомы В 1992 г. впервые была представлена бактериальная векторная система, позволяющая клонировать фрагменты чужеродной ДНК, протяженностью до 300 тыс. пар нуклеотидов. Она не заменима при создании и анализе генной билиотеки эукариот. Эта система поучила название BAC (bacterial artificial chromosome (англ.) бактериальная искусственная хромосома). Для ее создания используют половой фактор F E. coli. Фактор F используют для создания искусственных хромосом, поскольку он регулирует репликацию, а также контролирует копийность плазмид. Как уже обсуждалось выше, большинство векторных плазмид являются высококопийными, но в случае с большими вставками в плазмиду участков эукаротического генома это является не преимуществом, а недостатком. Быстрая репликация приводит к структурной нестабильности встроенных участков, часто наблюдается удаление фрагментов (делеция) или их перестановка (инверсия). Фактор F поддерживает низкую копийность плазмиды, не более 1 2 молекул на клетку. 50

50 Участок для рестриктазы Bam HI Cos Космида Участок для рестриктазы Sca I Cos Материнская ДНК, фрагменты которой необходимо клонировать ori-сайт Ген резистентности к тетрациклину tet r Обработка рестриктазой Sca I Sca I Cos Bam HI ori-сайт tet r Cos Sca I Обработка рестриктазой Bam HI Cos Bam HI Bam HI ori-сайт tet r Cos Обработка ДНК-лигазой фага Т4 Выделение фрагментов длиной ~ п.н. Cos Bam HI Bam HI ori-сайт tet r Cos п.н. Упаковка in vitro в головку бактериофага Головка бактериофага Отросток бактериофага Трансдукция E.coli Нить отростка E.coli Тетрациклин-устойчивые трансдуцированные клоны E.coli Рис Клонирование с помощью космидного вектора 51

51 В целом же векторные системы на основе фактора F содержат те же структурные компоненты, что и обычные векторы: промоторные участки, сайты для рестриктаз, cos-сайты бактериофага λ, гены устойчивости к антибиотику и т.д. ВАС система в испытаниях показала свою высокую стабильность и активно используется для создания библиотек фрагментов сложных геномов, в частности она сыграла существенную роль в картировании и секвенировании генома человека Клонирующие векторы на основе нитевидных фагов Все рассмотренные ранее векторные системы заключали в себе фрагменты чужеродной клонируемой ДНК, находящейся в двухцепочечной форме. Однако при определении последовательности нуклеотидов, выделении комплементарной РНК, при проведении работ по изучению мутации необходимо манипулировать с одноцепочечной ДНК. Поэтому были созданы векторные системы с одноцепочечной ДНК на основе нитевидных фагов E. coli. Кольцевая одноцепочечная ДНК таких фагов включает в себя порядка 6 тыс. пар нуклеотидов. Инфицировать и размножаться нитевидные фаги могут только на культурах E. coli, содержащих F-пили, т.е. только на мужских бактериальных клетках. Примерами бактериофагов, паразитирующих на клетках E. coli, являются М 13, fd, f1. Длина однонитевой ДНК фага достаточно удобна для генно-инженерных манипуляций и составляет около 6, 5 тыс. пар нуклеотидов. Репликативный цикл ДНК внутри инфицированной клетки типичен как для однонитевой ДНК, так и для (-) РНК содержащих вирусов. На первом этапе попадания в клетку хозяина материнская ДНК вируса, которую принято обозначать как (-) цепь, копируется бактериальными полимеразами, синтезирующими на ее матрице комплементарную (-) ДНК цепь. Таким образом формируется типичная двухцепочечная ДНК, с которой идет процесс транскрипции на м РНК, а затем трансляция фагового белка. После трансляции один из фаговых белков разрезает кольцевую двухцепочечную ДНК, начинается процесс репликации (+) ДНК цепи. Тот же белок сшивает концы (+) ДНК, т.е. формируется одноцепочечная кольцевая ДНК фага, которая упаковывается в фаговые частицы. Количество копий вновь формирующейся ДНК составляет молекул на клетку. Схема репликативного цикла вируса представлена на рис У нитевидных фагов есть две существенные особенности. Во-первых, их длина может существенно варьировать в зависимости от длины пакуемого генома. Поэтому при формировании рекомбинантной ДНК длина фага будет увеличиваться пропорционально длине встраиваемого участка чужеродной ДНК. Во-вторых, нитевидные фаги являются умеренными, а не литическими. Они не вызывают гибели бактериальных клеток, а постепенно выделяются из клетки. Однако процесс выделения фага является энергозависимым, поэтому постепенно энергетические ресурсы бактерии истощаются, сами 52

52 инфицированные клетки размножаются на 50% медленнее, чем непораженные. Поэтому при скрининге на бактериальном газоне ищут мутноватые бляшки. Одноцепочечная матричная ДНК фага (+) цепь Полимеразы E. coli Синтез (-) ДНК цепи, формирование двухцепочечной репликативной формы Высвобождение (-) цепи ДНК Репликация (+) ДНК нити Разрезание кольцевой репликативной формы Транскрипция, формирование мрнк фага Трансляция фагового белка Лигирование (сшивание) концов ДНК Регуляторные белки Структурные белки фага Одноцепочечная кольцевая (+) ДНК НИТЕВИДНЫЙ ФАГ Рис Схема воспроизводства нитевидного фага в бактериальной клетке E. coli У одноцепочечных нитевидных фагов имеется очень ограниченный участок генома, который можно заменять компонентами векторной системы. Как обычно, с целью трансформации в вектор в геном нитевидного фага добавляют полилинкер для небольшого набора рестриктаз и компонент для индикации трансформированных бактериальных клеток. Как правило, в качестве индикатора в систему вносят lac-оперон либо гены устойчивости к антибиотикам. Трансформированный нитевидный фаг быстро размножается на культуре клеток E. coli до высокого титра (до бляшко-образующих единиц/мл), т.е. хорошо и быстро нарабатываются одноцепочечные фрагменты чужеродной ДНК. Аналогично системе космид, включающих в себя и плазмиду и участок бактериофага λ, на основе нитевидных фагов также можно сформировать подобную гибридную систему. Созданы молекулярные векторы, совмещающие в себе генетические элементы плазмид и нитевидных фагов. Молекулярные векторы данного типа названы фагмидами. Эти структуры получили широкое распространение в генно-инженерном эксперименте. 53

53 7.5. Бифункциональные (челночные) векторы Хотя все процедуры молекулярного клонирования первоначально отрабатывались на клетках E. coli, не меньший интерес представляет и процесс трансформации векторами других бактерий, выступающих в качестве клетокхозяев. В частности, большое количество работ проделано на Bacteroides fragilis, Bacillus subtilis, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguis, Streptococcus pneumoniae, Agrobacterium tumefaciens и некоторых других видах бактерий. Однако генно-инженерные исследования проводятся не только на прокариотических клетках. Одним из наиболее используемых организмов среди эукариот являются дрожжевые грибы рода Saccaromyces. В настоящее время существует целый набор молекулярных векторов для Saccaromyces cerevisiae. Большое количество генно-инженерных объектов заставляет конструировать новые системы челночные векторы, которые позволили бы трансформировать сразу несколько хозяев. Челночные или бифункциональные векторы это векторы, способные существовать более чем в одном типе клеток, благодаря тому, что имеют два сайта начала репликации (рис. 7.3). Первый челночный вектор был создан в 1984 г. Эта векторная плазмида могла реплицироваться и в клетках E. coli и в клетках B. fragilis, благодаря тому, что имела два сайта начала репликации и генетические маркеры экспрессии для каждого из хозяев. Поскольку это челночный вектор для двух разных видов бактерий, он может в качестве системы селекции содержать ген резистентности к антибиотику. Гены репликации бактерии Ген устойчивости к антибиотику Челночный Вектор Начало репликации дрожжей Ген биосинтеза аминокислоты для отбора в дрожжах Участок множественного клонирования Центромерная узнающая последовательность Рис Схема строения челночного вектора для трансформации бактерий и дрожжей Гораздо больше задач приходится решать при создании челночных векторных систем для одновременной трансформации бактериальных и дрожжевых клеток. Помимо сайта начала репликации в дрожжевых клетках, вектор должен содержать гены, позволяющие плазмиде реплицироваться не только в бактериальной, но и в дрожжевой клетке. Это требование возникает изза различий в механизме репликации в эукариотах и прокариотах. При делении дрожжевых клеток удвоенные хромосомы разделяются с помощью системы микротрубочек, соединенных с центромерами. Поэтому конструируемый челночный вектор должен содержать последовательность, кодирующую 54

54 центромеру хромосомы дрожжей. И, наконец, важной задачей является система селекции. Действительно, на дрожжи не действуют антибиотики, убивающие бактерии. Поэтому обычно в качестве детектора используют ауксотрофные мутации. Получение мутаций клеток дрожжей достаточно простая задача, поскольку дрожжи имеют гаплоидный набор хромосом. Обычно для трансформации плазмидами используют штамм дрожжей с дефектом в гене для образования какой-либо аминокислоты (чаще всего лейцина). То есть при высаживании на среду, не содержащую лейцина, выживут только трансформированные вектором штаммы, не получившие челночного вектора с геном для синтеза лейцина погибнут. Не менее важным, чем дрожжи, объектом для создания челночных векторов являются цианобактерии, поскольку они способны вести процесс фотосинтеза сходным с растениями образом. Поскольку они имеют единственную хромосому, можно достаточно легко получать и характеризовать мутанты по всем интересующим генам. Исходя из специфики этих организмов, основным объектом для клонирования и изучения являются гены фотосинтетической системы. Наиболее активно развиваются исследования цианобактерии Anacystis nidulans. Трудности в создании челночных векторов, способных одновременно трансформировать и A. nidulans, и E. coli, заключались не только в разнице между репликативными системами этих организмов, но и в различном времени генерации: у цианобактерий оно обычно составляет ч, а у кишечной палочки около 30 мин. Зато достаточно просто оказалось подобрать селективную систему отбора, так как можно найти системы с одинаковой чувствительностью и устойчивостью к антибиотикам. Таким образом, бифункциональные векторы обычно создают для упрощения процедуры получения и отбора целевых молекул ДНК, при этом E. coli используют лишь в качестве промежуточного хозяина, на котором производится селекция, размножение и первичный анализ гибридных ДНК, а затем их вводят в бактерии других таксономических групп Искусственные хромосомы дрожжей Помимо челночных, существует три типа векторных систем для дрожжевых клеток: традиционные плазмидные (или эписомные) векторы, интегрирующие векторы и искусственные хромосомы дрожжей. Плазмидные векторы используются для получения гетерологичных белков, но только в малых лабораторных объемах, поскольку оказалось, что при выращивании в больших объемах эти системы не стабильны. Очевидным недостатком интегрирующих векторов является низкая копийность, так как после интеграции (встраивания) вектора в хромосомную ДНК экспрессируется только единственная копия гена. Поэтому наиболее используемой системой является искусственные хромосомы дрожжей YAC (yeast artificial chromosome (англ.) дрожжевая искусственная хромосома). Они предназначены для клонирования больших фрагментов ДНК (100 тыс. п.н. и более), т.е. их можно использовать для клонирования генов высших эукариот. В отличие от традиционных плазмидных кольцевых 55

55 хромосом, данная система является линейной. Название получено по аналогии с искусственной бактериальной хромосомой, однако дрожжевая хромосома содержит принципиально отличные от бактериальных последовательности. Для эффективного сохранения и наследования таких хромосом нужно, чтобы в них содержалось, как минимум, три основных элемента: 1) последовательность, функционирующая как сайт инициации репликации; 2) центромерная узнающая последовательность; 3) теломерные последовательности. Теломерами называют концевые элементы линейных хромосом, обеспечивающие их структурную целостность, стабильность и полноценную репликацию. Для практического использования вектора в него также должен быть встроен маркерный ген для последующей селекции трансформантов и участок множественного клонирования (рис.7.4). С помощью искусственных дрожжевых хромосом производилось картирование геномной ДНК человека и создавались геномные библиотеки, содержащие ДНК индивидуальных хромосом человека. Одним из основных преимуществ искусственных дрожжевых хромосом является то, что в одну дрожжевую клетку их можно внести в количестве нескольких штук. Теломера Участок множественного клонирования Теломера Tel ori Cen MCS Выбираемый маркер Tel Сайт начала репликации Центромерная узнающая последовательность Рис Искусственная дрожжевая хромосома 8. ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ С ПОМОЩЬЮ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ СИСТЕМ Самыми ранними и эффективными системами для экспрессии белка являлись клетки прокариот, в том числе E. coli. Однако для бактериальных клеток производимый в результате экспрессии рекомбинантных ДНК белок является гетерологичным, т.е. чужеродным, поэтому он нередко оказывался либо нестабильным, либо биологически не активным. Кроме того, медицинская (особенно фармацевтическая промышленность) предъявляет самые высокие требования к чистоте получаемых рекомбинантных белков, а в результате экстракции из бактериальной биомассы конечный продукт нередко загрязняется сопутствующими веществами, часть из которых может иметь токсический или пирогенный 16 характер. Все эти проблемы легко решаемы в том случае, если в 16 Пирогены вещества, вызывающие повышение температуры у человека и животных. 56

56 качестве экспрессирующей системы используются клетки эукариот. Основное преимущество таких систем возможность посттрансляционной модификации белков. В целом векторы, используемые в эукариотических системах, имеют ту же структуру, что и прокариотические аналоги. Они обязательно содержат следующие последовательности: 1) маркерный ген для последующей селекции трансформантов; 2) эукариотический промотор; 3) эукариотические сайты терминации транскрипции и трансляции; 4) сигнальный сайт для полиаденилирования мрнк. Могут быть использованы векторы в нескольких вариантах. Наиболее традиционными являются кольцевые плазмидные векторы, которые, помимо перечисленных последовательностей, содержат собственный сайт инициации репликации. В случае использовании плазмид выбор делают в пользу челночных векторов. Особую разновидность векторных систем представляют собой интегрирующие векторы. Они обязательно несут в себе последовательность, комплементарную определенному участку хромосомной ДНК хозяина хромосомный сайт интеграции, служащий для встраивания в хозяйскую хромосомную ДНК. Процесс внесения рекомбинантной ДНК в дрожжевые клетки называется трансформацией (по аналогии с бактериальными клетками), а внедрение в животные клетки обозначается термином трансфекция Системы экспрессии дрожжей Чаще всего в качестве эукариотической системы экспрессии используются дрожжи-сахаромицеты (Saccharomyces cerevisiae), поскольку они удобны в работе, хорошо изучены и имеют небольшой геном. Использование дрожжей экономически выгодно и безопасно для человека и животных. В клетках S. cerevisiae удается синтезировать белки высших эукариот, в гораздо большей степени соответствующие природным, чем белки, полученные при трансформации бактерий. Кроме того, удалось наладить успешный синтез ряда белков, несинтезируемых бактериальными системами. Важным свойством дрожжевых клеток является низкий уровень секреции экспрессируемых белков в окружающую среду, поэтому в случае секреции гетерологичного белка его последующее выделение и очистка не составляет особой проблемы. Использование дрожжей, благодаря хорошему знанию их генома, открывает большие перспективы в изучении мутаций. Штаммы, выделяемые из природных источников, диплоидны, но при некоторых условиях (например, под воздействием ацетата натрия) в них происходит мейоз, и диплоидная вегетативная клетка превращается в аск с четырьмя гаплоидными аскоспорами. Эта структура называется тетрадой. Тетраду разрушают, а аскоспоры по отдельности проращивают (наблюдается вегетативное размножение гаплоидов почкованием). Если генетический маркер 57

57 располагается на хромосоме, то в потомстве аскоспор он будет экспрессирован по-разному, а если он входит в состав внехромосомных элементов, то расщепления признака не происходит и во всех дрожжах он проявляется одинаково. Такой анализ называется тетрадным. В гаплоидной форме легко инициировать различные мутации, а затем при переходе в диплоидную оценивать является эта мутация доминантной или рецессивной. В результате подробного изучения мутантных штаммов более 400 генов S. cerevisiae распределено по 16 группам сцепления и составлена подробная генетическая карта. Гаплоидная клетка S. cerevisiae содержит 16 линейных хромосом, размер которых существенно меньше, чем у высших эукариот, и составляет около 250 тыс. п.н., поэтому они относительно просто могут быть разделены электрофоретически. Геном дрожжей только в три раза по объему превышает геном бактерий. Помимо хромосом, до 75 % лабораторных штаммов S. cerevisiae содержат плазмиду, которая была названа Scp 1. Она локализуется в ядре и в зависимости от штамма может быть представлена в количестве от 30 до 200 копий. Репликация плазмиды инициируется одновременно с репликацией хромосомной ДНК. На основе этой плазмиды и создаются основные векторы, т.е. конструируются гибридные ДНК, вводимые в клетки дрожжей. Чаще всего на их основе создают челночные векторы (рис. 8.1). Поэтому в качестве селективных маркеров удобнее использовать гены устойчивости к антибиотикам и токсическим соединениям. TRP 1 ARS CEN Sma I аmp r ori E плазмида YAC T T URA 3 Bam H1 Bam H1 Рис Кольцевая YAC плазмида для трансформации E.coli и S. cerevisiae: Система содержит селективный маркер для отбора E.coli (аmp r ) ген резистентности к ампициллину, сайт инициации репликации в клетках E.coli (ori E ), сайты для двух растриктаз Sma I по нему осуществляется рестрикция и последующее встраивание целевого гена и Bam HI по нему осуществляется линеаризация молекулы, т.е. первоначально кольцевой вектор при расщеплении рестриктазой Bam HI превращается в линейный с теломерными последовательностями на концах (Т). Помимо бактериальных, вектор содержит сегменты дрожжевой ДНК: CEN центромерная узнающая последовательность, ARS сайт инициации репликации в дрожжевых клетках, а также селективные маркеры для отбора трансформированных клонов дрожжей URA и TRP гены биосинтеза урацила и триптофана соответственно 58

58 Векторные системы для трансформации дрожжей перечислены в п Особенно интересной системой являются интегрирующие векторы. Интегрирующие векторы возникают благодаря процессу кроссинговера 17. Интеграция плазмидного гена в хромосому дрожжей может происходить как в результате двойного, так и одиночного кроссинговера (рис. 8.2). Например, в случае трансформации штамма дрожжей ауксотрофного по гистидину his бактериальной плазмидой с геном HIS, дающим возможность самостоятельно синтезировать гистидин, происходила гомологичная рекомбинация между плазмидой и дрожжевой хромосомой, в результате которой в дрожжевую хромосому интегрировался плазмидный ген HIS и дрожжи приобретали способность к синтезу гистидина. Рекомбинация в этом случае может происходить по двум разным механизмам. В первом случае между бактериальной плазмидой и дрожжевой хромосомой происходит двойной кроссинговер и сегмент his дрожжей полностью замещается на ген HIS бактериальной пламиды. Такая интеграция происходит в 10% случаев. В подавляющем большинстве реализуется второй вариант: происходит одиночный кроссинговер, и в хромосому дрожжей встраивается вся плазмида (рис. 8.2). Таким образом, в одной и той же хромосоме теперь содержатся и ген HIS и ген his, т.е. один и тот же ген оказался продублированным. Такая мутация носит название дупликации. Однако образующиеся тандемные дупликации являются крайне неустойчивым образованием, поэтому достаточно быстро происходит внутримолекулярная рекомбинация, в результате которой дрожжевая хромосома либо восстанавливает старый генотип his, либо приобретает принципиально новый HIS. Векторы, полученные на основе интеграции, обозначают YIP (yeast integrating plasmid (англ.) дрожжевая интегративная плазмида). Интегрировать в дрожжевую хромосому можно как кольцевые, так и линейные векторы. С помощью транспозонов в дрожжевую хромосому можно интегрировать до 10 копий чужеродных генов. Преимущества интегрирующих векторов перед автономными внехромосомными плазмидами заключается в их большей стабильности, так как последние достаточно быстро утрачиваются дрожжевыми клетками. Обычно в векторы дрожжей встраивают гены эукариотических организмов, но эти гены, как известно, имеют экзон-интронную 18 структуру. И хотя у сахаромицетов имеется собственная система сплайсинга, но она несколько отличается от сплайсинг-системы высших эукариот, поскольку экзон-интронная структура генов у S. cerevisiae встречается гораздо реже по сравнению с другими эукариотами. Поэтому для экспрессии в клетках дрожжей предпочтительно берут непрерывные последовательности, уже лишенные 17 Кроссинговер это процесс разрыва и воссоединения между различными нитями ДНК. В результате кроссинговера может произойти обмен частями хромосомы. Этот обмен называется рекомбинацией (под рекомбинацией понимают образование новых комбинаций генов, возникающих не только в результате кроссинговера, но и в ходе митоза и мейоза). Если обмениваются одинаковые фрагменты ДНК, то рекомбинация называется гомологичной, если между разными негомологичной. 18 Экзон фрагмент гена, несущий информацию о белке и остающийся в мрнк после посттранскрипционного сплайсинга, интрон фрагмент гена, не несущий информацию о белке и вырезаемый в ходе посттранскрипционного сплайсинга. 59

59 интронных вставок и не требующие сплайсинга. Для трансформации дрожжей векторами клеточную стенку удаляют химически (ацетатом лития) или энзиматически (глюкуронидазой или экстрактом пищеварительного сока виноградной улитки). Не менее распространенной является электрокорпорация. Двойной кроссинговер Одиночный кроссинговер 5`, 3`-рекомбинация 3`-рекомбинация Хромосома S.cerevisae Гомологичная рекомбинация информация бактериальной плазмиды Хромосома S.cerevisae Внутримолекулярная рекомбинация Рис Схема интеграции плазмиды в хромосому дрожжей в результате двойного или одиночного кроссинговера Интересной особенностью дрожжей, в отличие от бактериальных клеток является то, что в жидкой среде протопласты не могут восстанавливать разрушенную клеточную стенку, поэтому дрожжевые протопласты приходится смешивать с агаризованной средой и предварительно проращивать на чашках Петри. Протопласты с высокой эффективностью поглощают экзогенную ДНК в присутствии катионов кальция. Однако на практике чаще используют менее эффективную, но гораздо более быструю и дешевую «солевую» трансформацию дрожжей в присутствии ионов кальция и лития. Хорошо инициирует трансляцию и полиэтиленгликоль. В 1990 году был предложен метод введения плазмид, который был назван «генной пушкой». В этом случае ничем не обработанные дрожжи 60

60 бомбардировали разогнанными до большой скорости вольфрамовыми микрочастицами, на которых были адсорбированы различные векторы. При использовании генной пушки частота трансформации достигает 100%. Отобранные трансфомированные клоны выращивают на простых питательных средах (в том числе агаризованных), практически также, как бактерии. Поскольку массивная экспрессия чужеродного белка нередко вызывает чрезмерную метаболическую нагрузку на клетки дрожжей и в результате этого клетки гибнут, в настоящее время предпочтение отдается управляемым экспрессирующим системам. В таком случае отобранные клоны дрожжей выращивают в ферментерах до достижения необходимого количества биомассы, а затем добавляют в питательную среду вещество, инициирующее экспрессию целевого гена (например, растворимые соли меди). При использовании большинства векторных систем синтезируемые белки накапливаются в цитоплазме клетки-хозяина. Такой тип синтеза называется прямой экспрессией. Многие белки высших эукариот синтезируются в форме предшественников, секретирующихся из клеток. Если же белки такого типа в процессе синтеза остаются в цитоплазме, то они переходят в нерастворимую и неактивную форму. Поэтому при создании дрожжей-продуцентов одной из самых важных задач является подбор штаммов, обеспечивающих секрецию и сопутствующую ей модификацию белка. В отличие от бактериальных клеток дрожжи могут производить посттрансляционную модификацию белка (например, гликозилирование, частичный протеолиз, фосфорелирование) и его правильную пространственную укладку. Кроме того, большинство штаммов S. cerevisiae не выделяет в культуральную среду протеазы, поэтому целевой белок в случае его секреции в культуральную жидкость не разрушается. Важной особенностью S. cerevisiae является и то, что они вообще мало секретируют белки в окружающую среду, поэтому процесс очистки целевого белка оказывается технически не сложным. После синтеза рекомбинантных белков на рибосомах дрожжей под контролем сигнального пептида 19 белок-предшественник подвергается посттрансляционной модификации. Обычно она заключается в образовании дисульфидных связей, протеолитическом отщеплении отдельных фрагментов, гликозилировании. Эти процессы осуществляются при прохождении белка через аппарат Гольджи, откуда уже биологически активный белок в составе секреторного пузырька транспортируется к плазматической мембране. Пузырек сливается с мембраной и выбрасывает наружу свое содержимое. Однако, поскольку клетки дрожжей окружены не только мембраной, но и прочной клеточной стенкой, не все секретируемые белки выходят в культуральную жидкость. Часть из них (например, инвертаза и кислая фосфатаза) переносятся 19 Сигнальный пептид представляет собой пре-про-α фактор, состоящий из 19 аминокислот и в обязательном порядке содержащий дипептид лизин-аргенин. Гены, кодирующие этот фактор, обязательно располагаются перед встраиваемой в вектор кднк. Помимо инициирующей и направляющей функции, в процессе трансляции этот фактор выполняет также такие важные функции, как посттрансляционная модификация белка, им облегчается секреция белка через цитоплазматическую мембрану, в процессе чего сам сигнальный пептид отщепляется дрожжевой эндопротеиназой. После освобождения от этой лидерной последовательности белок приобретает окончательную нативную структуру. 61

61 только в периплазматческое пространство клетки. Оказалось, что эффективность секреции во многом зависит именно от природы сигнального пептида: лишь небольшое количество белков животного происхождения может полноценно секретироваться из дрожжей, используя собственные сигнальные пептиды. Гораздо более надежным является использование молекулярных векторов экспрессии-секреции, созданных на основе генетических элементов S. cerevisiae. У дрожжевой системы экспрессии наряду с очевидными достоинствами и преимуществами наблюдаются и некоторые недостатки. В частности, для ряда белков человека характерна такая модификация, которая не может быть реализована в S. cerevisiae. Например, многие белки человека, участвующие в процессе свертывания крови, подвергаются γ-карбоксилированию по остаткам глутаминовой кислоты, а в дрожжах такой системы посттрансляционной модификации нет. Следовательно, такие белки можно экспрессировать только в гомологичной системе (в клетках высших эукариот). Другими проблемами при создании дрожжевых экспрессионных систем является достаточно быстрая потеря плазмид (этот процесс несколько сдерживается использованием интегрирующих векторов), гипергликозилирование (гликозилирующий аппарат дрожжей способен присоединять до 100 остатков маннозы, тогда как в большинстве животных белков требуется не более 8 13 остатков на цепь). Тем не менее, дрожжевые системы экспрессии постоянно оптимизируются, и расширяется перечень видов, используемых для получения рекомбинантных белков. В качестве альтернативы S. cerevisiae в настоящее время используются Kluyveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Pichia pastoris и Hansenula polymorpha Системы экспрессии с использованием культур клеток насекомых Поскольку дрожжевые и бактериальные системы способны экспрессировать далеко не все животные белки, для производства рекомбинантных белков можно использовать клетки высших эукариот, в том числе насекомых. В этом случае в качестве векторной системы используются бакуловирусы 20. Бесспорным преимуществом бакуловирусов является их полная безвредность для человека, поскольку круг их хозяев ограничивается насекомыми. Для создания векторной системы на основе бакуловирусов были изучены гены полиэдрина и гранулина, поскольку уровень их экспрессии в зараженной клетке оказался выше всех известных вирусных белков. К концу инфекционного 20 Бакуловирусы относятся к оболочечным (сложным) вирусам и представляют собой нуклеокапсиды, заключенные в липопротеиновую оболочку. Вирусный геном представлен двойной кольцевой ДНК. Все бакуловирусы подразделяют на три группы: группа А представлена вирусами ядерного полиэдроза, которые в ядре клеток насекомых образуют кристаллические тельца включения полиэдры; группа В представлена вирусами гранулеза, образующими в цитоплазме клеток насекомых кристаллические овальные включения, образованные белком гранулином; группа С представлена бакуловирусами, не способными образовывать внутриклеточные включения. Поскольку вирусные включения в клетке хорошо идентифицируются при микроскопии (после применения соответствующих методов окрашивания), их можно использовать в качестве селективного маркера. Поэтому в качестве векторов обычно используют бакуловирусы групп А и В. 62

62 процесса он составляет 25% всего синтезируемого клеткой белка. Это указывает на наличие у гена полиэдрина сильного промотора. Оказалось, что если модифицировать или полностью убрать ген, кодирующий синтез полиэдрина после промоторной последовательности цикл воспроизводства новых вирусных частиц не нарушается. А значит, если вместо гена, кодирующего полиэдрин, встроить ген, кодирующий любой эукариотический белок (например, ген интерферона) и таким модифицированным вирусом заразить культуру пермиссивных клеток 21, то, наряду с воспроизводством новых бакуловирусных частиц, клетки насекомых будут активно экспрессировать ген интерферона и секретировать целевой продукт 22. Транскрипция генов полиэдрина и гранулина направляется вирусной РНКполимеразой, тогда как окончание транскрипции и посттранскрипционная модификация мрнк бакуловирусов осуществляется ферментами клеткихозяина. Но так как вирусная ДНК имеет большие размеры, в ней находится множество сайтов для ферментов-рестриктаз, поэтому классическая схема создания векторов оказывается неприемлемой (поскольку уже на первом этапе рестрикции ДНК окажется разрезанной ферментами на фрагменты разной длины и не сможет быть использована в дальнейшем в качестве вектора). Неклассическая схема создания вектора на основе бакуловирусной ДНК выглядит следующим образом: Создание транспортного плазмидного вектора, содержащего целевой ген (например, ген интерферона) трансфекция плазмидным вектором клеточной линии насекомых трансфекция той же клеточной линии бакуловирусом дикого типа (котрансфекция) гомологичная рекомбинация между плазмидной и вирусной ДНК, происходящая в результате двойного кроссинговера ген интерферона оказывается встроенным в ДНК бакуловируса отбор гибридных вирусов, содержащих рекомбинантную ДНК. Рассмотрим этот процесс подробнее. Поскольку прямое внесение целевого гена в ДНК бакуловирусов невозможно, вначале ген внедряют в транспортный вектор. Для этой цели можно использовать любой генно-инженерный вектор, сконструированный на базе плазмид E. coli. Однако этот транспортный вектор имеет целый ряд особенностей. Во-первых, целевой ген помещается между сильным промотором гена полиэдрина и сайтом терминации его транскрипции. Во-вторых, перед промотором и после сайта, кодирующего окончание транскрипции, помещают определенные участки генома бакуловируса (рис. 8.3). В этом случае говорят, что целевой ген фланкирован 23 последовательностями генов бакуловируса. То есть в созданной векторной системе целевой ген обеспечен как инициаций, так и терминацией транскрипции (за счет наличия промоторного и терминального сайта), а также благодаря 21 Пермиссивными клетками называют клетки, чувствительные к заражению вирусом, поскольку только в них возможно воспроизводство новых вирусных частиц. При попадании вируса в непермиссивную клетку инфекции не возникает. 22 В качестве вектора обычно используется вирус множественного ядерного полиэдроза калифорнийской совки Autographa californica (AcNPV), а в качестве экспрессирующей системы линия клеток гусениц Spodoptera frugiperda. 23 Фланкирование симметричное расположение объектов по сторонам от центральной оси. 63

63 фланкирующим последовательностям бакуловируса может обмениваться на гомологичные участки вирусного генома в процессе двойного кроссинговера. Созданной плазмидой трансфицируют пермиссивные клетки насекомых. Затем клетки заражают культурой бакуловируса дикого типа, т.е. происходит еще одна трансфекция клеток. Такое двойное внедрение разных ДНК-конструкций в клетку называется котрансфекцией. Внутри клеток между вирусной и плазмидной ДНК происходит двойной кроссинговер (рис.8.4). Векторная ДНК Фрагменты гена полиэдрина фланкируют целевой ген 5`- фрагмент гена полиэдрина промотор (Р) сайт терминации транскрипции (Тт) 3`- фрагмент гена полиэдрина Рис Участок транспортного плазмидного вектора, содержащего единицу экспрессии В результате него вирусная и плазмидная ДНК обмениваются участками (гомологичная рекомбинация). Результатом обмена становится приобретение плазмидой гена полиэдрина (эта конструкция в дальнейшей работе не нужна), а в вирус, вместо гена полиэдрина, встраивается последовательность: промотор целевой ген терминальный сайт транскрипции. Достаточно необычной является и селекция рекомбинантных бакуловирусов. При инфицировании культуры клеток те клетки, в которых вирус репродуцируются погибают. Поэтому в культуре появляются бреши, которые называют зонами лизиса или негативными колониями. В том случае, если негативная колония возникла в результате деятельности бакуловируса дикого типа, в ней обнаруживаются скопления полиэдров. Если же колония является результатом деятельности рекомбинантного вируса, у которого ген, кодирующий полиэдрин, заменен на целевой ген, то она не будет содержать матриксного белка, поскольку вместе с геном рекомбинантный вирус утрачивает и способность к синтезу полиэдрина. Селекцию можно провести и еще проще (см. п. 3, рис. 3.2): негативные колонии отпечатком переносят на нитроцеллюлозный пористый фильтр, а затем методами ДНК-гибридизации или полимеразной цепной реакции обнаруживают рекомбинантные бакуловирусы. Если же помимо целевого гена в вектор встроить ген lac Z, кодирующий β- галактозидазу, а в культуру клеток насекомых добавить хромогенный субстрат X-гал (рис. 3.2), то негативные бляшки, содержащие рекомбинантный вирус, будут окрашены в синий цвет. 64

64 Транспортный плазмидный вектор 5`, 3`-рекомбинация Рис Замещение гена полиэдрина в бакуловирусе дикого типа на единицу экспрессии транспортного плазмидного вектора в результате двойного кроссинговера в 5 и 3 фрагментах Рекомбинантные вирусы отбирают и трансфицируют ими новую культуру пермиссивных клеток насекомых. После заражения культура клеток насекомого-хозяина производит максимальное количество рекомбинантного белка на 4 5-е сутки. С помощью экспрессионной системы бакуловирусов уже получено около 500 различных гетерологичных белков, среди них такие важные для медицины, как интерферон и интерлейкин-2. При этом более 95% секретруемых белков имеют правильную посттрансляционную модификацию и укладку. Таким образом, генно-инженерная система с участием бакуловирусов, кроме высокой продуктивности, обеспечивает правильный процессинг чужеродных эукариотических белков. Первоначальный вариант бакуловирусного вектора был значительно модифицирован. Ген полиэдрина относится к поздним, а белки поздней стадии вирусного воспроизводства иногда модифицируются не до конца. Оказалось, 65

65 что и целевой белок иногда не проходит полную посттрансляционную модификацию после встраивания его гена после промотора полиэдрина. В этом случае ген целевого белка лучше встраивать после промотора генов, экспрессирующихся раньше, чем полиэдрин, например, после δ-промотора гена белка р После создания такого вектора, оказалось, что и биологическая активность у него выше, чем у исходного бакуловирусного вектора. Еще одна модификация преследовала цель обогащения потомства бакуловирусов гибридными вариантами, поскольку при селекции по обычной схеме векторных молекул в потомстве бакуловирусов обычно не более 0,8 2,3%. Оказалось, что если разрезать кольцевую ДНК бакуловируса по одному сайту, то инфекционная активность такой линеаризованной формы упадет в два раза, но способность к рекомбинации с транспортным плазмидным вектором значительно возрастает. При этом выход гибридных вирусов увеличивается в 10 раз. Для того, чтобы перевести ДНК бакуловируса из кольцевой в линейную форму, в нее встраивают уникальный сайт для рестриктазы Bsu361, а затем ДНК вируса обрабатывают этим ферментом. Но полноценно реплицироваться (то есть воспроизвести себе подобные молекулы) в клетке насекомых способны лишь кольцевые молекулы бакуловирусов. Чтобы вернуть себе кольцевую форму, линейная ДНК бакуловирусов начинает быстрее вступать в гомологичную рекомбинацию с транспортной плазмидой, забирая у нее участок клонированного гена и возвращая себе кольцевую форму (рис. 8.5). Такой метод обогащения гибридных клонов был остроумно назван методом спасения линейной ДНК вируса ядерного полиэдроза. Особенностью векторных бакуловирусов является и то, что на их основе можно конструировать системы, эффективно экспрессирующие два и более белка, но в этом случае каждый ген, кодирующий единичный белок, должен иметь собственный промотор и терминальный сайт транскрипции. Получение бакуловирусного вектора достаточно длительный процесс и занимает около 1,5 месяцев, гораздо быстрее получать челночные векторы, которые могут реплицироваться и в клетках E. coli, и в клетках культур тканей насекомых. При этом все манипуляции по созданию векторных систем и их селекции производятся в бактериальной клетке, а в клетках насекомых синтезируется рекомбинантный белок. Этот метод позволяет получить рекомбинантный вирус в течение недели. Готовую бакмиду выделяют из бактериальных клеток, анализируют правильность встраивания последовательностей, а затем трансфицируют ею культуру клеток насекомых, получают и очищают целевой белок. В эту векторную систему уже удалось встроить кднк структурных белков вируса гепатита С. При заражении культуры клеток насекомых такими бакмидами выявили не просто синтез структурных белков вируса гепатита С, но и сборку вирусоподобных частиц, покрытых оболочкой. В связи с тем, что даже отдельные белки вируса гепатита 24 Белок р 10 транслируется раньше полиэдрина, он отвечает за формирование волокон, образующих электронно-плотные скопления в ядре и цитоплазме. Поскольку на электронной микроскопии эти волокна выявляются также хорошо, как зерна ганулина или скопления полиэдрина, то его можно использовать в качестве маркера. 66

66 С практически не возможно выделить из организма зараженных людей, а сам вирус не культивируется на клеточных культурах, полученный с помощью бакмид результат представляет собой огромную важность, прежде всего для попытки создания эффективной вакцины против гепатита С. Имея на руках модельный вирус можно также, подробно изучив особенности его репликации, создавать противовирусные химиопрепараты. Линейная ДНК бакуловируса единица экспрессии Линейная ДНК не реплицируется ДНК бакуловируса Практически все потомство бакуловирусов содержит в себе рекомбинантную (гибридную) ДНК Рис Схема спасения линейной ДНК вируса ядерного полиэдроза 67

67 8.3. Экспрессирующие системы на основе клеток млекопитающих Используя культуру клеток насекомых, можно получать рекомбинантный белок, максимально соответствующий природным аналогам, благодаря наличию системы посттрансляционной модификации. Однако полной гомологии белков млекопитающих удается добиться только в том случае, если в качестве системы экспрессии использовать культуру тканей млекопитающих. В этом случае в качестве основы для создания клонирующих векторов удобно использовать вирусы. Обычно для трансфекции клеточных линий млекопитающих используют гибридные плазмиды, которые могут эффективно реплицироваться как в клетках млекопитающих, так и бактериях, т.е. челночные векторы. В качестве обязательных компонентов векторы содержат: сайт инициации репликации в бактериальной клетке (ori E ); сайт инициации репликации в клетках млекопитающих (ori euk ) 25 ; целевой ген, находящийся под контролем промотора 26 и оканчивающийся сайтом терминации транскрипции, 27 и селективные маркерные гены для отбора. Обобщенная схема экспрессирующего вектора для млекопитающих представлена на рис P Tт аmp R ori E ori euk Рис Челночная плазмида для экспрессии белка в клетках млекопитающих: ori E сайт инициации репликации в E. coli; ori euk сайт инициации репликации в клетках млекопитающих; Р промотор; Тт терминатор транскрипции; аmp R ген резистентности к ампициллину С помощью селективных маркеров удается определить трансформированные клоны среди бактериальных клеток и трансфицированные клоны среди клеток млекопитающих. Для селекции трансформированных бактериальных клонов обычно используются гены устойчивости к антибиотикам (например, ампициллину). Гораздо сложнее устроена система селекции для отбора трансфицированных клеток млекопитающих (рис. 8.7). 25 Обычно в качестве сайта инициации репликации в клетках эукариот используется сайт инициации вирусов человека и животных (например, сайт инициации обезьяньего вируса SV 40, вируса папилломы быка, аденовирусов, герпесвирусов и т.д.). 26 Сильными промоторами для экспрессирующих систем на основе клеток млекопитающих являются либо промоторы ДНК вирусов (цитомегаловируса человека, SV 40 и т.д.), либо промоторы генов млекопитающих (тимидинкиназы, бычьего гормона роста и т.д.). 27 Сайт терминации (окончания) транскрипции обычно выполняет также функцию сигнала полиаденилирования образующейся мрнк. 68

68 Делеция гена, кодирующего фермент Фермент Дефектная по ферменту клеточная линия Трансфекция Токсический метаболит В клетку внесена челночная плазмида с геном, кодирующим нужный фермент в качестве селективного маркера Гибель клеток Фермент Токсический метаболит Выжили только трансфицированные клетки Рис Схема отбора трансфицированных клеток млекопитающих, с использованием в качестве селективного маркера гена, кодирующего синтез фермента Принцип ее работы основан на следующем: для трансфекции используется клеточная линия, дефектная по какому-либо ферменту. Если в среду для культивирования добавить токсический метаболит, который в норме должен разрушаться этим ферментом, то клетки погибнут из-за отсутствия фермента. Но если предварительно дефектную клеточную линию трансфицировать челночной плазмидой (в ней содержится ген, кодирующий синтез фермента), то ферментативная активность клеточной линии восстанавливается и после внесения токсического метаболита клетки выживают 28. Использование 28 В качестве современных систем отбора трансфицированных клеток млекопитающих можно привести следующие примеры: 1. Использование в качестве токсического агента генетицина, который в дефектных клеточных линиях блокирует трансляцию. В этом случае дефектные клеточные линии трансфицируют плазмидой, содержащей ген Neo r, который кодирует фермент неомицинфосфотрансферазу. Если клетка трансфицируется плазмидой, содержащей этот селективный маркер, то неомицинтрансфераза фосфорелирует и инактивирует генетицин, и клетки выживают и размножаются на среде с генетицином, а если плазмида не попадает в клетку, то в результате токсического действия метаболита клетка погибает. 2. В качестве токсического метаболита выбирают метотрексат. В этом случае используют клеточные линии, у которых в результате мутации инактивирован фермент дигидрофолатредуктаза (ДГФР). В эти клеточные линии вносят челночные плазмиды, содержащие в качестве селективного маркера ДГФР-ген, а затем в среду добавляют метотрексат. В среде с метотрексатом выживают и пролиферируют только трансфицированные клетки. 69

69 токсических метаболитов в качестве селективного прессинга удобно еще и потому, что можно постепенно увеличивать концентрацию в среде токсического агента. При этом выживать будут только клеточные линии с большим количеством копий вектора, т.е. линии-сверхпродуценты рекомбинантного белка. Сверхпродукция белка в этом случае оказывается результатом амплификации (появления множественных копий) гена, кодирующего целевой белок. Увеличения выхода продукта иногда удавалось достигнуть и благодаря встраиванию между промотором и целевым геном интронной последовательности (рис. 8.8). Чтобы достигнуть эффекта сверхпродукции белка координируют экспрессию целевого гена с экспрессией селективного маркерного гена, для этого просто помещают и тот и другой ген под контроль одного промотора, их разделяют только небольшие интронные последовательности. Селективный маркер Целевой ген Векторная ДНК Промотор Интронные последовательности Терминатор транскрипции Рис Координирование экспрессии целевого гена и гена селективного маркера, путем включения их под контроль одного промотора и одного сайта окончания транскрипции Нанесенная на клетки млекопитающих незащищенная вирусная нуклеиновая кислота не способна их инфицировать, поскольку, во-первых, обладает низкой трансформирующей активностью, а, во-вторых, быстро расщепляется клеточными нуклеазами, находящимися в среде. Поэтому для эффективной трансфекции разработаны специальные методы, способствующие проникновению нуклеиновой кислоты в клетку и ее защите от воздействия эндонуклеаз. Такие эффекты наблюдаются при трансфекции клеток в присутствии гипертонического раствора (1 М NaCl, CaPO 4 ), воздействии поликатиона диэтиламиноэтилдекстрана или диметилсульфоксида (стимуляция пиноцитоза и защита от деградации нуклеазами). В настоящее время активно разрабатывается метод микроинъекции в клетку малых количеств вирусной ДНК с помощью стеклянных микрокапилляров. Преимуществом метода перед остальными является целенаправленная доставка вируса в заданную область (например, ядро), а недостатками низкая производительность и сложность метода. Этих недостатков лишены липосомный 29 метод и метод введения ДНК с помощью катионных липидных детергентов (липофектин, липофектамин, селфектин). Схемы введения ДНК с использованием этих методов представлены на рис Липосомы это полые везикулы, ограниченные фосфолипидным бислоем. В липосомы можно заключать не только ДНК, но и различные лекарственные препараты. Поскольку мембрана липосом состоит из природных фосфолипидов, они не токсичны, биодеградируемы, обеспечивают сохранность и адресную доставку ДНК внутрь клеток. 70

70 Липосома Катионный липидный детергент ДНК вируса Клетка млекопитающего ДНК вируса Ядро Комплекс ДНКкатионный липидный детергент Клетка млекопитающего Липосома ДНК вируса Ядро а) Ядро Клетка б) млекопитающего Рис Введение нуклеиновой кислоты в клетки млекопитающих с помощью: а липосомного метода объединение бислоя фосфолипидов липосомы и мембраны клетки и с помощью б метода использования катионных липидных детергентов, компенсирующих отрицательный заряд ДНК Все перечисленные методы оказались эффективны не только для инфицирования клеток вирусами, но и для трансфекции плазмидами, в том числе и челночными, применяемыми в качестве основных векторов в системах экспрессии на клеточных линиях млекопитающих. Некоторые ценные белки в активной форме состоят из разных полипептидных цепей и являются димерами, тетрамерами и т.д. Чтобы получить биологически активный белок можно клонировать гены, кодирующие разные цепи отдельно, трансфицировать ими разные клетки, а затем полученные рекомбинантные субъединицы смешать. Однако в этом случае редко удается добиться правильной укладки белка, поскольку быстрая, эффективная и функционально активная укладка осуществляется только внутри клеток. Первым шагом разрешения этой проблемы явилось создание отдельных векторов для разных субъединиц и трансфекция ими одной и той же клетки млекопитающего. Оказалось, что если клетка компетентна (способна поглощать чужеродную ДНК), то она с высокой эффективностью поглощает оба вектора. 71

71 Котрансфекция приводит к тому, что клетка экспрессирует сразу обе субъединицы целевого белка с разных векторов. В этом случае сборка белка происходит внутри клетки млекопитающего, и в результате получается белок, совершенно аутентичный нативному. Однако оказалось, что клетки, содержащие два вектора, могут постепенно утрачивать один из них. Если же утраты вектора не происходит, одна из двух плазмид может быть представлена в большем количестве копий, чем другая, соответственно конечный выход целевого белка будет ограничиваться вектором, находящимся в меньшем количестве. Поэтому в настоящее время конструируются векторы, включающие в себя сразу обе субъединицы целевого белка. Чтобы скоординировать количественный выход этих пептидных цепей, их помещают под контроль одного промотора и сайта терминации транскрипции. По-аналогии с дрожжевыми экспрессионными системами можно получить интегрируемые векторы для клеток млекопитающих. Однако если у дрожжей происходит исключительно гомологичная рекомбинация (рис. 8.2), то в клетках млекопитающих экзогенные молекулы интегрируются в геном хозяина преимущественно за счет негомологичной рекомбинации. При котрансфекции интеграция в геном клетки осуществляется в виде множественных копий, при этом участки целевых генов оказываются тесно сцепленными. Такой вариант трансфекции наиболее желаем, поскольку, во-первых, позволяет получать достаточно высокий уровень выхода целевого белка, во-вторых, формируемые клоны котрансформантов наиболее устойчивы и не теряют интегрированную ДНК даже при многократных пассажах культур клеток. При работе с любой экспрессирующей системой, особенно с культурами клеток млекопитающих, постоянно возникает потребность в регулируемом «включении-выключении» экспрессии целевого гена. Поэтому в векторных системах целевой ген обычно находится под контролем индуцируемого промотора. Можно использовать промоторы, индуцируемые катионами тяжелых металлов, гормонами или тепловым шоком. Однако основным недостатком таких агентов является низкая селективность, так как под их воздействием экспрессируются не только внесенные трансгенные структуры, но и многие собственные гены клетки. Поэтому в настоящее время стараются создать специфические регулируемые системы экспрессии. В их основу положена хорошо известная система репрессор-оператор-индуктор лактозного оперона E. coli 30. Коротко напомним, что перед началом синтеза белка необходимо снять с ДНК транскрипт (копию) мрнк. Для этого к промоторному участку гена присоединяется фермент РНК-полимераза. Именно на этом этапе возможна как позитивная регуляция помощь в синтезе белка, так и негативная регуляция когда существует запрет на присоединение РНК-полимеразы, а соответственно и прекращается синтез белка. Позитивная регуляция осуществляется очень просто, как правило, по механизму субстратного регулирования. Например, 30 Подробно устройство и принцип регуляции лактозного оперона рассматривается в [5]. 72

72 возьмем синтез индуцибельного 31 белка мальтозы. Если в питательной среде для бактерий не содержится мальтозы, то белок-активатор находится в «нерабочей» конформации и не помогает РНК-полимеразе соединяться с промотором гена, кодирующего синтез мальтазы, и фермент, разрушающий мальтозу, не синтезируется. Если же в питательную среду добавить мальтозу, то дисахарид соединяется с белком-активатором, который немедленно меняет свою конформацию 32, переходя в «рабочую» форму. В такой форме он помогает РНКполимеразе соединиться с промотором и начать снимать копии мрнк. Позитивную регуляцию можно представить в виде следующей схемы: Субстрат (мальтоза) + Белок-активатор Рабочая форма белка-активатора Помощь белка-активатора ферменту РНК-полимеразе Присоединение РНК-полимеразы к промотору Синтез мрнк Синтез фермента (мальтазы), утилизирующего субстрат. Сложнее работает система отрицательной (негативной) регуляции. При негативной регуляции участок между промотором и геном разделен небольшой последовательностью, называемой оператором. РНК-полимераза соединяется с промотором и начинает процесс транскрипции, если с оператором не связано никаких белков, то фермент, беспрепятственно двигаясь по ДНК, полностью считывает информацию. Но с оператором может быть связан белок, который называется репрессором. Если белок-репрессор встает на пути РНК-полимеразы, то фермент не может двигаться по молекуле ДНК, т.е. мрнк не транскрибируется и синтеза белка не происходит. Белок-репрессор может находиться в двух состояниях: 1) «нерабочее» эта конформация наблюдается в том случае, если белокрепрессор соединяется с низкомолекулярными соединениями и отрывается от оператора; 2) «рабочее» белок-репрессор прочно связан с оператором и препятствует транскрипции мрнк. Негативную регуляцию обычно рассматривают на примере лактозного оперона. Когда в среде отсутствует лактоза и синтез β-галактозидазы не нужен, белок-репрессор находится в «рабочем» состоянии и связан с оператором, препятствуя работе РНК-полимеразы. Но если в среду попадает лактоза, она соединяется с белком-репрессором и переводит его в «нерабочее» состояние. Репрессор отсоединяется от оператора, запрет на работу РНК-полимеразы снимается и начинается транскрипция мрнк, а затем синтез β-галактозидазы. Поскольку результатом внесения в среду низкомолекулярных соединений (сигнальных молекул) является синтез белка, такие вещества называют индукторами. Мощным индуктором для лактозного оперона, помимо лактозы, является изопропил-β-d-тиогалактопиранозид (ИПТГ). 31 Ферменты бактериальной клетки условно разделяют на две группы: конститутивные продуцируются бактериальной клеткой постоянно и индуцибельные синтезируются только при наличии в среде соответствующего субстрата. 32 Белки, которые способны менять свою конформацию в результате присоединения низкомолекулярных соединений, называются аллостерическими. 73

73 Для создания системы направленной регуляции генов конструируются сложные гибридные векторы, которые, помимо типичных структур (рис. 8.6), включают в себя оператор лактозного оперона (его располагают сразу после промотора), ген, кодирующий синтез белка-репрессора, и ген, кодирующий синтез РНК-полимеразы. В этом случае экспрессия целевого белка осуществляется следующим образом: клетки млекопитающих трансфицируют гибридными плазмидами, проводят селекцию клеток, содержащих плазмиду. Потом трансфицированные клеточные линии размножают (клонируют). На всех этих этапах синтеза целевого белка не происходит, поскольку синтезируется белок-репрессор и связывается с оператором, предотвращая связывание и продвижение РНКполимеразы (а она в клетке уже присутствует, поскольку ее синтез с плазмиды не ограничен регуляторными элементами). Когда биомасса накоплена до заданного количества, в среду вносят ИПТГ. Этот индуктор связывается с белком-репрессором и переводит его в «нерабочее» состояние. Инактивирование репрессора приводит к связыванию РНК-полимеразы с промотором и беспрепятственному продвижению ее по операторному участку. То есть следствием внесения в среду ИПТГ является синтез целевого белка в тот момент, когда это требуется. Описанная система регуляции является настолько универсальной, что используется в регуляции экспрессии рекомбинантных белков и в эукариотических, и в прокариотических клетках, и, кроме того, применяется в трансгенных животных и растениях. 9. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ БАКТЕРИЙ И ПОЛУЧЕНИЕ ЦЕЛЕВОГО ПРОДУКТА После отбора трансформированных клонов бактерий приступают к промышленному получению целевого белка. Это процесс многоступенчатый, связанный с постепенным наращиванием объема продукции биомассы. Сначала исходную культуру выращивают на пробирках со скошенным агаром, затем инкубируют ее во встряхиваемой колбе или на матрацах, после чего переносят в ферментер и культивируют в промышленном масштабе. На определенной стадии ферментации производят индукцию синтеза целевого белка внесением в культуральную среду сигнальных молекул (например, ИПТГ), а по завершении процесса клетки отделяют от культуральной жидкости центрифугированием или фильтрацией. Возможны два варианта месторасположения целевого белка. В первом случае он активно секретируется в культуральную жидкость. Этот вариант является более выгодным, поскольку не требует дополнительных материальных и временных затрат на дезинтеграцию клеток. К сожалению, лишь очень небольшое количество белков, экскретируется бактериями в питательную 74

74 среду 33. Во втором случае целевой белок сконцентрирован внутри бактериальной клетки (он может располагаться как в цитоплазме, так и в периплазматическом пространстве). Такой вариант секреции требует разрушения (дезинтеграции) бактерий и последующего отделения содержимого клеток от разрушенных клеточных стенок. Технологическая схема очистки целевого продукта с учетом внеклеточной и внутриклеточной локализации белка представлена на рис Сбор из ферментёра культуральной жидкости Разделение культуральной жидкости (центрифугированием) Надосадочная жидкость Бактериальные клетки Концентрирование Дезинтеграция Очистка белка Центрифугирование Содержимое бактериальных клеток Разрушенные клеточные стенки бактерий Очистка белка Сброс Целевой продукт Рис Технологическая схема очистки целевого белка Таким образом, если продукт представляет собой белок, находящийся в культуральной среде, то среду концентрируют, а белок очищают хроматографически или другими методами. Если продукт представляет собой низкомолекулярное соединение, находящееся в 33 В качестве примера секретируемых в среду белков можно привести Ig A-протеазу гонококка, гораздо большее количество белков синтезируется в периплазматическое прстранство. 75

75 культуральной среде, то используют соответствующие методы экстракции. И, наконец, если продукт имеет внутриклеточную локализацию, то прежде чем очищать его, клетки необходимо разрушить. Для разрушения клеток используют разнообразные химические, биологические и физические методы. Все процедуры должны быть достаточно жесткими, чтобы разрушить клеточную стенку, и в тоже время достаточно мягкими, чтобы исключить денатурацию белка. Поскольку клеточные стенки у разных микроорганизмов состоят из разных полимеров, никакого универсального метода их разрушения не существует. Многообразные методы разрушения клеток суммированы на рис Методы дезинтеграции Механические Немеханические Твёрдофазные Жидкофазные Лизис Сушка Размол Физический Химический Ферментативный Экструзия Осмотический шок Автолиз Перемешивание Декомпрессия Ультразвук Соударение Замораживание - оттаивание Детергенты Антибиотики Реагенты разной природы Ферментолиз Фаголизис Рис Методы дезинтеграции бактериальных клеток После разрушения клеток их осколки удаляют либо низкоскоростным центрифугированием, либо микрофильтрацией через мембрану. Белковый продукт можно осадить из грубого или осветленного лизата органическими растворителями (спиртом или ацетоном) или сульфатом аммония. К сожалению, дороговизна агентов, использующихся для осаждения, может значительно увеличить стоимость процесса. Поэтому в качестве альтернативы для концентрирования и выделения суммарных белков используют ультрафильтрацию. Этот подход пригоден для работы с объемами от одного до нескольких тысяч литров, может идти непрерывно и обеспечивать 76

76 многократное обогащение среды конечным продуктом. Необходимая степень очистки белкового продукта зависит от того, где его намереваются использовать. В одних случаях это может быть довольно грубый препарат (для пищевой и сельскохозяйственной промышленности), в других (медикофармацевтическая промышленность, научные эксперименты) препарат высокой степени чистоты. Обычно целевой продукт извлекается не ультрафильтрацией, а экстрагированием или сорбцией на твердом носителе. Сорбционные методы представляют собой выделение растворённого в жидкой фазе компонента с помощью твёрдофазного сорбента. Различают четыре модификации сорбционных методов: 1) ионный обмен. Ионообменный метод основан на способности специальных сорбентов ионообменных смол сорбировать биологически активные вещества, имеющие ионную природу (т. е. являющиеся кислотой, основанием или солью), благодаря эквивалентному обмену между ионами вещества, находящегося в растворе, и ионами сорбента; 2) адсорбция микропористыми сорбентами. Процесс адсорбции практически ничем не отличается от ионного обмена, с той лишь разницей, что на микропористых сорбентах обычно сорбируются не ионы, а целиком молекулы, чаще неполярных веществ; 3) хроматография метод, основанный на избирательном поглощении отдельных компонентов анализируемой смеси различными адсорбентами. Адсорбентами называют твёрдые тела, на поверхности которых происходит поглощение адсорбируемого вещества: раствор смеси веществ, подлежащих разделению, пропускают через адсорбционную колонку, заполненную адсорбентом. Вследствие различной адсорбируемости и скорости передвижения отдельных веществ, находящихся в анализируемом растворе, компоненты смеси удерживаются на различной высоте столба адсорбента в виде отдельных зон; 4) биосорбция процессы, в которых в качестве сорбента используются сами микроорганизмы, клетки или их компоненты. Наиболее широко используемым методом для получения целевого белка является хроматография. Для получения высокочистого белка используют аффинную хроматографию метод, основанный на исключительной способности биологически активных веществ связывать специфически и обратимо другие вещества. Слабое обратимое взаимодействие между молекулами биополимеров и сорбентов может осуществляться за счет сил биологического характера. Такие силы действуют, например, между ферментом и субстратом, антигеном и антителом, гормоном и рецептором. Для осуществления фракционирования по биологическому сродству один из «партнеров» такой пары (лиганд) химически закрепляют на матрице сорбента, а сорбцией (связыванием с лигандом) и элюцией (снятием с сорбента) второго «партнера» управляют путем изменения условий 77

77 биологического взаимодействия в результате введения в элюент солей, мочевины, детергентов, конкурирующих молекул. Принцип работы аффинной хроматографической колонки заключается в следующем: 1-й этап образец вводят в колонку; 2-й этап через колонку пропускают буферный раствор, в результате чего молекулы, у которых нет сродства к неподвижной фазе, вымываются из колонки, а молекулы с высоким сродством к неподвижной фазе удерживаются в колонке; 3-й этап удерживаемые молекулы элюируются из колонки буферным раствором с высокой концентрацией соли, или с другим значением рн, или растворителем другого состава. Лиганды готовят, используя ряд белковых зацепок или меток, которые не должны вызывать неестественных взаимодействий и изменять конформацию присоединяемого к ним белка. Широко распространенными являются полигистидиновые метки (рис. 9.3). Типичная зацепка содержит 8 12 гистидиновых остатков. Она способна связываться с соединениями никеля, находящимися на поверхности хроматографических гранул. Рис Прикрепление белка с гистидиновой зацепкой к грануле в аффинной колонке Самым большим преимуществом аффинной хроматографии является то, что с помощью этого метода можно не только получать белковые препараты высокой чистоты, но и «исправлять» изначально функционально не активные белки. Рисунок 9.4 демонстрирует вариант аффинной хроматографии, в котором неправильно свернутый белок с помощью шаперонов сворачивается правильным образом и элюируется буферным раствором. Шаперон взаимодействует с образцом белка и катализирует его сворачивание в правильной конформации. Аффинную связь вещества с сорбентом можно нарушить либо непосредственно, путем создания неблагоприятных для биоспецифического взаимодействия условий, либо конкурентной элюцией. Биоспецифическое взаимодействие реализуется за счет: электростатического притяжения разноименно заряженных групп, водородных и ван-дер-ваальсовых сил, гидрофобного взаимодействия. Биоспецифичность определяется конформационным соответствием участков связывания, что приводит к суммированию различных взаимодействий, осуществляющихся одновременно 78

78 в нескольких точках. Ослабление биоспецифических сил связывания может быть достигнуто обычными приемами: изменением рн, увеличением ионной силы и температуры элюента, введением в его состав органических растворителей или детергентов. К такому же эффекту могут приводить воздействия денатурирующих веществ, нарушающих само конформационное соответствие (мочевины, гуанидинхлорида и др.). Хроматографическая колонка Неправильно свернутый белок Шаперон, связанный с гранулой Белок взаимодействует с шапероном Гранула в колонке Правильно свернутый белок Рис Исправление свертывания плохо или неправильно сворачивающихся белков Высокая степень аффинного сродства в некоторых случаях может быть нарушена только путем использования столь жестких условий, что они могут привести к необратимой денатурации белка. Этот обстоятельство можно обойти, используя конкурентный вариант элюции. В этом случае в состав элюента вводят растворенный лиганд, тоже обладающий биоспецифическим сродством к элюируемому веществу (аффинная элюция). Им может быть точно такой же лиганд, который иммобилизован на матрице. Благодаря специфической конкуренции очищаемое вещество может постепенно сниматься с матрицы и элюироваться в виде комплекса с аффинным элюентом. Аффинная хроматография отличается чрезвычайно высокой избирательностью, присущей биологическим взаимодействиям. Нередко одна хроматографическая процедура позволяет очистить нужный белок в тысячи раз. Способ связывания биологически активного лиганда с 79

Занятие 6. ВЕКТОРНЫЕ СИСТЕМЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ В КЛЕТКАХ ПРОКАРИОТ И ЭУКАРИОТ.

Занятие 6. ВЕКТОРНЫЕ СИСТЕМЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ В КЛЕТКАХ ПРОКАРИОТ И ЭУКАРИОТ. Занятие 6. ВЕКТОРНЫЕ СИСТЕМЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ В КЛЕТКАХ ПРОКАРИОТ И ЭУКАРИОТ. Цель занятия: ознакомиться с плазмидными, фаговыми и космидными векторами, освоить методы введения и клонирования

Подробнее

Технология рекомбинантной ДНК

Технология рекомбинантной ДНК Технология рекомбинантной ДНК Рекомбинантная ДНК искусственно созданная последовательность ДНК путем объединения нескольких последовательностей ДНК Части рекомбинантной ДНК могут быть получены исскуственным

Подробнее

РАЗДЕЛ II ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ ОСНОВНЫЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

РАЗДЕЛ II ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ ОСНОВНЫЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ РАЗДЕЛ II ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ ОСНОВНЫЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ Генная инженерия это отрасль молекулярной биологии и генетики, целью которой является получение с помощью лабораторных приемов организмов с новыми,

Подробнее

ТРАНСГЕНЕЗ. МИКРООРГАНИЗМЫ. ВВЕДЕНИЕ В БИОТЕХНОЛОГИЮ Лекция 5

ТРАНСГЕНЕЗ. МИКРООРГАНИЗМЫ. ВВЕДЕНИЕ В БИОТЕХНОЛОГИЮ Лекция 5 ТРАНСГЕНЕЗ. МИКРООРГАНИЗМЫ ВВЕДЕНИЕ В БИОТЕХНОЛОГИЮ Лекция 5 Перспективы развития генетической инженерии 1 2 3 4 Получение ДНК зондов для исследования структуры, функций и экспрессии генов Развитие «обратной

Подробнее

Глава 11 Методы анализа генов

Глава 11 Методы анализа генов Глава 11 Методы анализа генов 1. CS Ферменты рестрикции: a) используются в ПЦР; b) узнают одноцепочечную ДНК; c) узнают и разрезают специфические двуцепочечные последовательности ДНК; d) встречаются у

Подробнее

П Р О Г Р А М М А спецкурса "ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ" для биологов и химиков 4 курса ФЕН. Лектор проф. С.Н. Щелкунов. (32 часа).

П Р О Г Р А М М А спецкурса ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ для биологов и химиков 4 курса ФЕН. Лектор проф. С.Н. Щелкунов. (32 часа). П Р О Г Р А М М А спецкурса "ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ" для биологов и химиков 4 курса ФЕН. Лектор проф. С.Н. Щелкунов. (32 часа). 1.1. "ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ". Естественно-научный раздел, вузовская компонента

Подробнее

ТЕХНОЛОГИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК

ТЕХНОЛОГИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК 11 ТЕХНОЛОГИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК Расшифровывая тайны структуры генов, ученые начали их выделять и синтезировать. 30 лет назад тех, которые верили в успех этих начинаний было мало, и никто даже не предполагал

Подробнее

«МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ С ОСНОВАМИ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ»

«МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ С ОСНОВАМИ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ» МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФГБОУ ВПО «УЛЬЯНОВСКАЯ ГСХА им. П.А.Столыпина» Факультет ветеринарной медицины Кафедра биологии, ветеринарной генетики, паразитологии и экологии РАБОЧАЯ

Подробнее

УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ. Институт биохимической технологии и нанотехнологии (ИБХТН)

УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ. Институт биохимической технологии и нанотехнологии (ИБХТН) БИЛЕТ 1 1. История развития биотехнологии и основные ее аспекты. 2. Рекомбинантные молекулы ДНК, их получение и использование. 3. Непрерывное культивирование микроорганизмов. Хемостатный метод культивирования.

Подробнее

Белорусский государственный университет

Белорусский государственный университет Белорусский государственный университет Генная инженерия Учебная программа (рабочий вариант) по специальности: 1-31 01 01 Биология (по направлениям) направление 1-31 01 01-03 Биология (биотехнология) Факультет

Подробнее

Занятие 5. ФЕРМЕНТЫ РЕСТРИКЦИИ (РЕСТРИКТАЗЫ I, II ТИПОВ), ДНК-ЛИГАЗЫ

Занятие 5. ФЕРМЕНТЫ РЕСТРИКЦИИ (РЕСТРИКТАЗЫ I, II ТИПОВ), ДНК-ЛИГАЗЫ Занятие 5. ФЕРМЕНТЫ РЕСТРИКЦИИ (РЕСТРИКТАЗЫ I, II ТИПОВ), ДНК-ЛИГАЗЫ Цель занятия: ознакомиться с ферментами рестрикции и способами получения гибридной ДНК от различных организмов, освоить методы гибридизации

Подробнее

Лабораторная работа 12. ОСНОВЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ

Лабораторная работа 12. ОСНОВЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ Лабораторная работа 12. ОСНОВЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ Цель занятия: ознакомиться с основными инструментами генетической инженерии ферментами рестрикции, ДНК-лигазой и способами получения гибридной ДНК

Подробнее

Методические рекомендации для самостоятельной работы обучающихся по дисциплине. Сельскохозяйственная биотехнология

Методические рекомендации для самостоятельной работы обучающихся по дисциплине. Сельскохозяйственная биотехнология ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ОРЕНБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» Методические рекомендации для самостоятельной

Подробнее

Генетическая инженерия

Генетическая инженерия *Генная Инженерия Генетическая инженерия Генетическая инженерия (генная инженерия) совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток),

Подробнее

Генетическая рекомбинация - это перераспределение генетического материала (ДНК), приводящее к возникновению новых комбинаций генов.

Генетическая рекомбинация - это перераспределение генетического материала (ДНК), приводящее к возникновению новых комбинаций генов. Генетическая рекомбинация - это перераспределение генетического материала (ДНК), приводящее к возникновению новых комбинаций генов. Рекомбинация может происходить путем обмена клеточными ядрами, целыми

Подробнее

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Уральский государственный университет им. А.М. Горького» ИОНЦ «Экология и природопользование»

Подробнее

Библиотеки генов. Электрофорез в агарозном геле. Гибридизация колоний

Библиотеки генов. Электрофорез в агарозном геле. Гибридизация колоний Библиотеки генов Электрофорез в агарозном геле Гибридизация колоний Прокрашивание бромистым этидием Блот-гибридизация ДНК Чтобы решить задачу поиска индивидуального гена какого-либо организма, надо проанализировать

Подробнее

ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА

ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА Подготовка высококвалифицированных специалистов-биологов требует овладения ими знаний в различных областях современной биологии. Наиболее развивающейся областью биологической науки

Подробнее

ДНК ДИАГРАММА 01: Что такое ДНК? Какую структуру имеет ДНК? Глава 1: Что такое ДНК? Рекомендуемые фильмы

ДНК ДИАГРАММА 01: Что такое ДНК? Какую структуру имеет ДНК? Глава 1: Что такое ДНК? Рекомендуемые фильмы ДНК БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ И ДНК ДНК Глава 1: Что такое ДНК? Что такое ДНК? ДНК это длинная макромолекула внутри клетки, несущая в себе генетическую информацию о синтезируемых белках. Генетический код образован

Подробнее

Преподавание курса фармацевтической биотехнологии

Преподавание курса фармацевтической биотехнологии Преподавание курса фармацевтической биотехнологии в ММА им. И.М.Сеченова. 1 Целью изучения курса биотехнологии студентами фармацевтических факультетов медицинских вузов является: формирование системных

Подробнее

Рестриктазы - группа бактериальных нуклеаз. Рестриктазы - это ферменты, обладающие эндонуклеазной активностью, которые специфически гидролизуют

Рестриктазы - группа бактериальных нуклеаз. Рестриктазы - это ферменты, обладающие эндонуклеазной активностью, которые специфически гидролизуют Рестриктазы - группа бактериальных нуклеаз. Рестриктазы - это ферменты, обладающие эндонуклеазной активностью, которые специфически гидролизуют молекулы двухцепочечных ДНК при наличии в них определенных

Подробнее

4. Перечень разделов и (или) тем дисциплины и их дидактическое содержание. История развития биотехнологии и ОПК-11,

4. Перечень разделов и (или) тем дисциплины и их дидактическое содержание. История развития биотехнологии и ОПК-11, 1. Целью изучения дисциплины является: ознакомление студентов с современным состоянием медицинской биотехнологии; формирование у студентов системных знаний по фундаментальным понятиям биомедицинской науки;

Подробнее

Белорусский государственный университет

Белорусский государственный университет Белорусский государственный университет «30» июля 2015 г. Регистрационный УД 550 /уч. Молекулярная биотехнология Учебная программа учреждения высшего образования по учебной дисциплине для специальности:

Подробнее

Глава 13 Рекомбинация

Глава 13 Рекомбинация Глава 13 Рекомбинация 1. CS Мейоз обеспечивает: a) рост организма; b) рекомбинацию у прокариот; c) мутационную изменчивость; d) комбинативную изменчивость; e) лишь фенотипическую изменчивость. 2. CS Какое

Подробнее

МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОВ

МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОВ 12 МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОВ Гены являются молекулярным субстратом наследственности. Структура и локализация генов в геноме определяет свойства организма. При функционировании генома и в результате взаимодействия

Подробнее

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН Западно-Казахстанский государственный университет им.м.утемисова РАБОЧАЯ УЧЕБНАЯ ПРОГРАММА MONI 1101 Молекулярные основы наследственности и изменчивости

Подробнее

Занятие 7. СОВРЕМЕННЫЕ МОЛЕКУЛЯРНО- БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА ДНК. Цель занятия: ознакомиться с основными молекулярнобиологическими

Занятие 7. СОВРЕМЕННЫЕ МОЛЕКУЛЯРНО- БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА ДНК. Цель занятия: ознакомиться с основными молекулярнобиологическими Занятие 7. СОВРЕМЕННЫЕ МОЛЕКУЛЯРНО- БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА ДНК Цель занятия: ознакомиться с основными молекулярнобиологическими методами анализа ДНК. 1. Определение нуклеотидной последовательности

Подробнее

Министерство образования Республики Беларусь Учебно-методическое объединение вузов Республики Беларусь по естественнонаучному образованию

Министерство образования Республики Беларусь Учебно-методическое объединение вузов Республики Беларусь по естественнонаучному образованию Министерство образования Республики Беларусь Учебно-методическое объединение вузов Республики Беларусь по естественнонаучному образованию УТВЕРЖДАЮ /Первый з'а^с-титель Министра образования Генная инженерия

Подробнее

Тема: «Нуклеиновые кислоты. ДНК»

Тема: «Нуклеиновые кислоты. ДНК» Глава I. Основы цитологии На дом: 12 Тема: «Нуклеиновые кислоты. ДНК» Задачи: Дать характеристику нуклеиновым кислотам: видам НК, локализации их в клетке, строению, функциям. Изменено, дополнено Нуклеиновые

Подробнее

Генетическая рекомбинация - это перераспределение генетического материала (ДНК), приводящее к возникновению новых комбинаций генов.

Генетическая рекомбинация - это перераспределение генетического материала (ДНК), приводящее к возникновению новых комбинаций генов. РЕКОМБИНАЦИЯ Генетическая рекомбинация - это перераспределение генетического материала (ДНК), приводящее к возникновению новых комбинаций генов. Пути рекомбинации: - обмен клеточными ядрами - обмен целыми

Подробнее

КОНТРОЛЬНЫЕ ЗАДАНИЯ для проверки освоения по дисциплине «Ведение в биотехнологию» для студентов 5 курса биологического факультета, ОЗФО

КОНТРОЛЬНЫЕ ЗАДАНИЯ для проверки освоения по дисциплине «Ведение в биотехнологию» для студентов 5 курса биологического факультета, ОЗФО КОНТРОЛЬНЫЕ ЗАДАНИЯ для проверки освоения по дисциплине «Ведение в биотехнологию» для студентов 5 курса биологического факультета, ОЗФО Вопросы и письменные задания по теме: «Введение в проблему. История

Подробнее

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. по проведению семинарских занятий по курсу

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. по проведению семинарских занятий по курсу 1 МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Подробнее

Александр Вячеславович Качан, доцент кафедры молекулярной биологии Белорусского государственного университета, кандидат биологических наук

Александр Вячеславович Качан, доцент кафедры молекулярной биологии Белорусского государственного университета, кандидат биологических наук Учебная программа составлена на основе ОСВО 1-31 01 01-2013, ОСВО 1-31 01 03-2013, типовой учебной программы ГЕННАЯ ИНЖЕНЕ- РИЯ. ТД-G. 531/тип. 2015 г. и учебных планов УВО G31-129/уч. 2013 г., G31-131/уч.

Подробнее

Изменчивость бактерий

Изменчивость бактерий Изменчивость бактерий Мутанты Нормальная частота спонтанных мутаций одна на 10 6 10 8 клеток. Клетки ауксотрофы потеря способности синтезировать один из компонентов компонентов клетки. Прототрофы сохраняют

Подробнее

РАБОЧАЯ ПРОГРАММА УЧЕБНОЙ ДИСЦИПЛИНЫ

РАБОЧАЯ ПРОГРАММА УЧЕБНОЙ ДИСЦИПЛИНЫ ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНСТВО НАУЧНЫХ ОРГАНИЗАЦИЙ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК УТВЕРЖДАЮ Заместитель директора по научной работе ИНЦ РАН д.б.н.

Подробнее

4. Структура и содержание дисциплины. Общая трудоемкость дисциплины составляет 4 зачетных единиц 144часа Структура дисциплины.

4. Структура и содержание дисциплины. Общая трудоемкость дисциплины составляет 4 зачетных единиц 144часа Структура дисциплины. Н см Семес тр Недел я семест ра 1. Цели освоения дисциплины. Целью дисциплины «Генная инженерия» является ознакомление студентов с теоретическими основами, методами и технологиями получения рекомбинантных

Подробнее

Медицинская биология и общая генетика. Лекция 5. Лектор: кандидат биологических наук, доцент Давыдов Владимир Витольдович

Медицинская биология и общая генетика. Лекция 5. Лектор: кандидат биологических наук, доцент Давыдов Владимир Витольдович Медицинская биология и общая генетика Лекция 5 Лектор: кандидат биологических наук, доцент Давыдов Владимир Витольдович Развитие генно-инжененрных методов Методы получения генетического материала Конструирование

Подробнее

Особенности организации прокариотной клетки

Особенности организации прокариотной клетки Прокариотная клетка Особенности организации прокариотной клетки Эукариотная клетка Признак Прокариотная клетка Эукариотная клетка Организация генетического материала Локализация ДНК Цито плазматические

Подробнее

Белорусский государственный университет

Белорусский государственный университет Белорусский государственный университет УТВЕРЖДАЮ Проректор по учебной работе А.Л. Толстик 2013 г. Регистрационный УД - /баз. Селекция продуцентов Учебная программа учреждения высшего образования по учебной

Подробнее

ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ НАСЛЕДСТВЕН- НОСТЬ И ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ НАСЛЕДСТВЕН- НОСТЬ И ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ Лекция 6. ема: ЦИОПЛЗМИЧЕСКЯ НСЛЕДСВЕН- НОСЬ И ГЕННЯ ИНЖЕНЕРИЯ 1. Цитоплазматическая наследственность. Наряду с ядерными генами, локализованными в хромосомах, обнаружены факторы наследственности, расположенные

Подробнее

Министерство образования Республики Беларусь Учебно-методическое объединение по естественнонаучному образованию. УТВЕРЖДАЮ Первый замее^да^н: Республи

Министерство образования Республики Беларусь Учебно-методическое объединение по естественнонаучному образованию. УТВЕРЖДАЮ Первый замее^да^н: Республи Министерство образования Республики Беларусь Учебно-методическое объединение по естественнонаучному образованию УТВЕРЖДАЮ Первый замее^да^н: Республи стра образования Регистрацион С.бЪ^ /тип. Генная инженерия

Подробнее

СОВРЕМЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

СОВРЕМЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ А.Г. ПЕСНЯКЕВИЧ СОВРЕМЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ Учебное пособие по факультативу для учащихся 11 классов общеобразовательных учреждений Минск 2010 Оглавление 1. Общие представления о

Подробнее

Основные генетические механизмы

Основные генетические механизмы Основные генетические механизмы Тренинг «Использование методики Xpert MTB/RIF», г.душанбе, 29 июля 2 августа 2013 г. Презентация подготовлена в рамках проекта USAID «Посилення контролю за туберкульозом

Подробнее

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «НИЖЕГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ им. Р.Е.

Подробнее

ррнк Рибосомальная РНК входит в состав рибосом, сложных надмолекулярных структур, которые состоят из четырех типов ррнк и нескольких десятков белков.

ррнк Рибосомальная РНК входит в состав рибосом, сложных надмолекулярных структур, которые состоят из четырех типов ррнк и нескольких десятков белков. ррнк Рибосомальная РНК входит в состав рибосом, сложных надмолекулярных структур, которые состоят из четырех типов ррнк и нескольких десятков белков. Рибосомальная РНК составляет большую долю (до 80%)

Подробнее

РАБОЧАЯ ПРОГРАММА ПЕДАГОГА

РАБОЧАЯ ПРОГРАММА ПЕДАГОГА Муниципальное автономное общеобразовательное учреждение г. Калининграда гимназия 32 РАБОЧАЯ ПРОГРАММА ПЕДАГОГА Федосеевой Натальи Петровны Ф.И.О. Элективного курса биологии для 10-в класса_ Предмет, класс

Подробнее

УЧЕБНАЯ ПРОГРАММА. Прикладная молекулярная биология

УЧЕБНАЯ ПРОГРАММА. Прикладная молекулярная биология Федеральное агентство по образованию Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева УТВЕРЖДАЮ Ректор РХТУ им. Д.И. Менделеева В.А. Колесников " " 2008 г. УЧЕБНАЯ ПРОГРАММА Прикладная

Подробнее

Характеристика ДНК и РНК

Характеристика ДНК и РНК Характеристика ДНК и РНК ДНК выполняет следующие функции: 1. Участвует в копировании генетического материала (репликации) и передаче его дочерним клеткам в ходе их деления. 2. Обеспечивает - экспрессию

Подробнее

Использование антисмысловой РНК для подавления функции гена muts в Escherichia coli MG1655

Использование антисмысловой РНК для подавления функции гена muts в Escherichia coli MG1655 Использование антисмысловой РНК для подавления функции гена muts в Escherichia coli MG1655 Автор(ы): Поддъяков Иван Школа: 2086 Класс: 10 Руководители: Бубнов Дмитрий Михайлович, сотрудник ВКПМ, ФГУП ГосНИИГенетики

Подробнее

«МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»

«МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ» ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНАЯ (ОБЩЕРАЗВИВАЮЩАЯ) ПРОГРАММА «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ» Направленность: естественнонаучная Уровень программы - базовый Возраст обучающихся - 15-18 лет Срок реализации программы

Подробнее

Министерство образования Республики Беларусь Учебно-методическое объединение вузов Республики Беларусь по естественнонаучному образованию

Министерство образования Республики Беларусь Учебно-методическое объединение вузов Республики Беларусь по естественнонаучному образованию Министерство образования Республики Беларусь Учебно-методическое объединение вузов Республики Беларусь по естественнонаучному образованию УТВЕРЖДАЮ Первый,-за'мес!и;е;11. Министра образования Рсску^хиет.

Подробнее

Лекция 7. Нуклеиновые кислоты Структура ДНК Синтез ДНК Мутации Структура РНК

Лекция 7. Нуклеиновые кислоты Структура ДНК Синтез ДНК Мутации Структура РНК Лекция 7 Нуклеиновые кислоты Структура ДНК Синтез ДНК Мутации Структура РНК Нуклеиновые кислоты ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) ирнк (рибонуклеиновая кислота) линейные полимеры, мономерами которых

Подробнее

УТВЕРЖДАЮ Зав. кафедрой биохимии и биофизики С.Б. Бокуть 2014 г. ВОПРОСЫ

УТВЕРЖДАЮ Зав. кафедрой биохимии и биофизики С.Б. Бокуть 2014 г. ВОПРОСЫ УТВЕРЖДАЮ Зав. кафедрой биохимии и биофизики С.Б. Бокуть 2014 г. ВОПРОСЫ для подготовки к экзамену по дисциплине «Биотехнология» для студентов 5 курса специальности 1-80 02 01 «Медико-биологическое дело»

Подробнее

Предлагаемая книга является первым наиболее полным и авторитетным руководством по интенсивно развивающейся области науки молекулярной генетике,

Предлагаемая книга является первым наиболее полным и авторитетным руководством по интенсивно развивающейся области науки молекулярной генетике, Предлагаемая книга является первым наиболее полным и авторитетным руководством по интенсивно развивающейся области науки молекулярной генетике, аналогов которому в мировой научной литературе нет. Издание

Подробнее

Структура работы: всего 19 заданий из них : 15 заданий- части А 2 задания части В и 2 задания части С

Структура работы: всего 19 заданий из них : 15 заданий- части А 2 задания части В и 2 задания части С КАРТА ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА ЗНАНИЙ БИОЛОГИЯ 9 класс (1 триместр) Проверяемые понятия и темы : Разделы биологии, раскрывающие общие закономерности организации, значение биологических знаний для познания окружающего

Подробнее

Тема 1. Химический состав клетки Задания части А

Тема 1. Химический состав клетки Задания части А Тема 1. Химический состав клетки Задания части А Выберите один ответ, который является наиболее правильным 1. Назовите органические соединения, которые содержатся в клетке в наибольшем количестве (в %

Подробнее

РАБОЧАЯ ПРОГРАММА ПО ЭЛЕКТИВНОМУ КУРСУ «Основы биотехнологии» 10 класс (профильный уровень)

РАБОЧАЯ ПРОГРАММА ПО ЭЛЕКТИВНОМУ КУРСУ «Основы биотехнологии» 10 класс (профильный уровень) РАБОЧАЯ ПРОГРАММА ПО ЭЛЕКТИВНОМУ КУРСУ «Основы биотехнологии» 10 класс (профильный уровень) Составитель: Воробьева Оксана Владимировна, учитель биологии Белгород 2013/2014 учебный год Пояснительная записка

Подробнее

Использование генетики

Использование генетики Использование генетики БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ И ДНК ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГЕНЕТИКИ Глава 1: Клонирование Что такое клон? Клон это организм, генетически идентичный другому организму. Клоны появляются естественным путём

Подробнее

в дидактических единицах дисциплины 1 ОК-1, ОК-7, ОПК-2, ОПК-4, ОПК-6, ПК-1 ПК-2, ПК-3, ПК-8, ДК-1, ДК-2, ДК-3

в дидактических единицах дисциплины 1 ОК-1, ОК-7, ОПК-2, ОПК-4, ОПК-6, ПК-1 ПК-2, ПК-3, ПК-8, ДК-1, ДК-2, ДК-3 1. Целями изучения является: ознакомить студентов с современным состоянием науки «Молекулярная биология», дать им знания о фундаментальных понятиях молекулярной биологии и их значении для медицины, воспитать

Подробнее

«^>храд%эй Ш>52012 г.

«^>храд%эй Ш>52012 г. Белорусский государственный университет УТВЕРЖДАЮ Декан биологического факультета,, ^-,J. Лысак 1Г1ЧНЫ \у «^>храд%эй Ш>501 г. Регистрационный Векторные системы Учебная программа (рабочий вариант) для специальностей:

Подробнее

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНТИКА

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНТИКА МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНТИКА МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ ДНК ЭУКАРИОТ Организм Количество репликонов Средний размер репликона, тыс.п.н. Скорость движения репликативной вилки, п.н./сек. 1 4200 50000 500 40

Подробнее

Белорусский государственный университет

Белорусский государственный университет Белорусский государственный университет «30» ноября 2016 г. Регистрационный УД - 3285 /уч. Технология рекомбинантных ДНК Учебная программа учреждения высшего образования по учебной дисциплине для специальности:

Подробнее

1. Организационно-методические данные дисциплины

1. Организационно-методические данные дисциплины ПК-2 способностью изучать научно-техническую информацию отечественного и зарубежного опыта по тематике исследования ПК-5 способностью проводить ветеринарно-санитарную экспертизу сырья и продуктов животного

Подробнее

Разнообразие вирусов. прокариот. Рисунок 1. Различные вирусы прокариот [Joanne M. Willey et al. 2008].

Разнообразие вирусов. прокариот. Рисунок 1. Различные вирусы прокариот [Joanne M. Willey et al. 2008]. 3.2. Вирусы Эубактерий и Архебактерий. Разнообразие вирусов прокариот. Синтез белка и нуклеиновых кислот, сборка вирусных частиц. Рнк- и ДНК- фаги. Лизирующие и лизогенные вирусы. Вирусы Эубактерий и Архебактерий.

Подробнее

Глоссарий. Генетически модифицированные (трансгенные организмы, ГМО, ТГО) ГЕНЕТИЧЕСКИ ИЗМЕНЕННЫЙ ОРГАНИЗМ (ГИО)

Глоссарий. Генетически модифицированные (трансгенные организмы, ГМО, ТГО) ГЕНЕТИЧЕСКИ ИЗМЕНЕННЫЙ ОРГАНИЗМ (ГИО) Глоссарий ГМ Генетически модифицированные (трансгенные организмы, ГМО, ТГО) ГЕНЕТИЧЕСКИ ИЗМЕНЕННЫЙ ОРГАНИЗМ (ГИО) Генная инженерия (молекулярная биотехнология, молекулярное клонирование) генно-инженерная

Подробнее

РАБОЧАЯ ПРОГРАММА УЧЕБНОЙ ДИСЦИПЛИНЫ. Генетическая инженерия

РАБОЧАЯ ПРОГРАММА УЧЕБНОЙ ДИСЦИПЛИНЫ. Генетическая инженерия Санкт-Петербургский государственный политехнический университет УТВЕРЖДАЮ Декан ФМФ В.К. Иванов г. РАБОЧАЯ ПРОГРАММА УЧЕБНОЙ ДИСЦИПЛИНЫ Генетическая инженерия Кафедра-разработчик Биофизика Направление

Подробнее

VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика » ноября 2010 года

VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика » ноября 2010 года VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010» 24-26 ноября 2010 года Секция 5. Контроль качества и безопасности пищевых продуктов МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ

Подробнее

МОЛЕКУЛЯРНО- ГЕНЕТИЧЕСКИЙ МЕТОД

МОЛЕКУЛЯРНО- ГЕНЕТИЧЕСКИЙ МЕТОД P A R T N E R ' S P R E S E N T A T I O N МОЛЕКУЛЯРНО- ГЕНЕТИЧЕСКИЙ МЕТОД Вороная Ю.М 1мед 1группа S E C T I O N F O U R МОЛЕКУЛЯРНО - ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ Большая и разнообразная группа методов, предназначенная

Подробнее

Тема «Молекулярные механизмы генетических процессов. Генетическая роль ДНК и РНК, ее доказательство» РЕПОЗИТОРИЙ БГПУ

Тема «Молекулярные механизмы генетических процессов. Генетическая роль ДНК и РНК, ее доказательство» РЕПОЗИТОРИЙ БГПУ Тема «Молекулярные механизмы генетических процессов. Генетическая роль ДНК и РНК, ее доказательство» Молекулярная генетика - раздел генетики и молекулярной биологии, изучающий материальные основы наследственности

Подробнее

Пояснительная записка Цель Задачи Содержание рабочей программы Демонстрация схем:

Пояснительная записка Цель Задачи  Содержание рабочей программы Демонстрация схем: Пояснительная записка Рабочая программа элективного курса по биологии «Молекулярная генетика и генная инженерия» для 10 класса разработана в соответствии с законом «Об образовании в Российской Федерации»

Подробнее

Резюме - краткое изложение информации по какому-либо изученному материалу. Необходимо изложить пройденную тему в 5-7 предложениях, используя термины.

Резюме - краткое изложение информации по какому-либо изученному материалу. Необходимо изложить пройденную тему в 5-7 предложениях, используя термины. Задания для внеаудиторной работы студентов специальности медицинская биохимия 1 курс. Резюме - краткое изложение информации по какому-либо изученному материалу. Необходимо изложить пройденную тему в 5-7

Подробнее

3. Объем дисциплины и виды учебной работы:

3. Объем дисциплины и виды учебной работы: 1. Цели и задачи дисциплины: Цель дисциплины сформировать у студентов знания об использовании в промышленности физико-химических принципов работы живой клетки, ознакомить с методами и технологиями производства

Подробнее

Молекулярная биология

Молекулярная биология Молекулярная биология Курс лекций для студентов IV курса факультета биологии РГПУ им. А.И. Герцена Профессор кафедры Зоологии, д.б.н., профессор Цымбаленко Надежда Васильевна Т Р А Н С К Р И П Ц И Я (прокариоты)

Подробнее

Отложенные задания (30)

Отложенные задания (30) Отложенные задания (30) Вставьте в текст «ДНК» пропущенные термины из предложенного перечня, используя для этого цифровые обозначения. Запишите в текст цифры выбранных ответов, а затем получившуюся последовательность

Подробнее

Глава 8 Ген. 1. CS Понятие "ген" было предложено: a) Г. Менделем; b) Т. Морганом; c) В. Иогансеном; d) Дж. Уотсоном; e) О. Эйвери.

Глава 8 Ген. 1. CS Понятие ген было предложено: a) Г. Менделем; b) Т. Морганом; c) В. Иогансеном; d) Дж. Уотсоном; e) О. Эйвери. Глава 8 Ген 1. CS Понятие "ген" было предложено: a) Г. Менделем; b) Т. Морганом; c) В. Иогансеном; d) Дж. Уотсоном; e) О. Эйвери. 2. CS Выберите ответ не соответствующий характеристике гена: a) содержит

Подробнее

АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЕ ПРЕПАРАТЫ

АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЕ ПРЕПАРАТЫ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЕ ПРЕПАРАТЫ Терминология Антибиотики (АБ) вещества различного происхождения, способные подавлять рост определенных микроорганизмов или вызывать их гибель. 2 типа АБ по характеру действия:

Подробнее

ДНК-ЗОНДЫ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ВИРУСОЛОГИИ Галина Я.С., Николаева О.Н. ФГБОУ ВО Башкирский ГАУ Уфа, Россия

ДНК-ЗОНДЫ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ВИРУСОЛОГИИ Галина Я.С., Николаева О.Н. ФГБОУ ВО Башкирский ГАУ Уфа, Россия ДНК-ЗОНДЫ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ВИРУСОЛОГИИ Галина Я.С., Николаева О.Н. ФГБОУ ВО Башкирский ГАУ Уфа, Россия THE DNK-PROBES AND THEIR USE IN VIROLOGY Galina Y.S., Nikolaeva O.N. The Bashkir State Agrarian

Подробнее

«Химические основы биологических процессов» * Часть I. Текущие вопросы ТЕМА 1. Что такое жизнь с точки зрения химика. 1. Многообразие и систематика

«Химические основы биологических процессов» * Часть I. Текущие вопросы ТЕМА 1. Что такое жизнь с точки зрения химика. 1. Многообразие и систематика «Химические основы биологических процессов» * Часть I. Текущие вопросы ТЕМА 1. Что такое жизнь с точки зрения химика. 1. Многообразие и систематика 2. Строение клеток 3. Биологические полимеры три основных

Подробнее

ПРОГРАММА. дополнительного образования. по общей биологии для 11 класса. «Удивительная молекула ДНК»

ПРОГРАММА. дополнительного образования. по общей биологии для 11 класса. «Удивительная молекула ДНК» ПРОГРАММА дополнительного образования по общей биологии для 11 класса «Удивительная молекула ДНК» С середины ХХ века в области молекулярной биологии был сделан большой прорыв, который разгадал тайны главной

Подробнее

Контрольная работа за первое полугодие в 10 классе. Вариант 1. ЧАСТЬ 1 А1. К прокариотам относятся 1) растения 2) животные 3) грибы 4) бактерии и

Контрольная работа за первое полугодие в 10 классе. Вариант 1. ЧАСТЬ 1 А1. К прокариотам относятся 1) растения 2) животные 3) грибы 4) бактерии и Контрольная работа за первое полугодие в 10 классе. Вариант 1. ЧАСТЬ 1 А1. К прокариотам относятся 1) растения 2) животные 3) грибы 4) бактерии и цианобактерии А2.Принцип комплементарности лежит в основе

Подробнее

РЕПЛИКАЦИЯ И РЕПАРАЦИЯ ДНК

РЕПЛИКАЦИЯ И РЕПАРАЦИЯ ДНК 7 РЕПЛИКАЦИЯ И РЕПАРАЦИЯ ДНК Репликация ДНК это молекулярный процесс точного копирования молекул ДНК (ее нуклеотидной последовательности). С помощью механизма репликации происходит точная передача генетической

Подробнее

Глава 1: Клетки. В1. Почему для клеточной мембраны важно обладать избирательной проницаемостью?

Глава 1: Клетки. В1. Почему для клеточной мембраны важно обладать избирательной проницаемостью? Клетка БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ И ДНК КЛЕТКА Глава 1: Клетки Что такое клетка? Все организмы состоят из клеток, будь то одноклеточные организмы бактерии, либо многоклеточные, такие как растения и животные. Клетка

Подробнее

Белорусский государственный университет

Белорусский государственный университет Белорусский государственный университет «30» июля 2015 г. Регистрационный УД - 806 /уч. Векторные системы Учебная программа учреждения высшего образования по учебной дисциплине для специальностей: 1-31

Подробнее

Введение в молекулярную биологию (для информатиков) Александр Предеус Институт биоинформатики

Введение в молекулярную биологию (для информатиков) Александр Предеус Институт биоинформатики Введение в молекулярную биологию (для информатиков) Александр Предеус Институт биоинформатики Урок 1.1 Основные концепции молекулярной биологии молекулы, составляющие клетку биополимеры: ДНК, РНК, протеины

Подробнее

ОРГАНИЗАЦИЯ НАСЛЕДСТВЕННОГО МАТЕРИАЛА

ОРГАНИЗАЦИЯ НАСЛЕДСТВЕННОГО МАТЕРИАЛА Занятие 6. Тема: ОРНИЗИЯ НСЛЕДСТВЕННОО МТЕРИЛ (занятие I) " " 200 г ель занятия: изучить молекулярную природу гена, его свойства; научиться решать задачи, раскрывающие строение молекул ДНК и РНК, по репликации,

Подробнее

Тема 2. «Прикладные аспекты биотехнологии».

Тема 2. «Прикладные аспекты биотехнологии». 1. Цель и задачи программы Данная программа предназначена для подготовки к вступительным испытаниям в аспирантуру по направлению подготовки 06.06.01 Биологические науки, научная специальность 03.01.06

Подробнее

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ Учебно-методическое объединение по естественнонаучному образованию. Селекция продуцентов

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ Учебно-методическое объединение по естественнонаучному образованию. Селекция продуцентов МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ Учебно-методическое объединение по естественнонаучному образованию УТРЕЕЖДАЮ?фвьій "заместитель Министра образования Йс'публики BeWpycb, 4 Ж " ' > '' А'- '/У

Подробнее

Молекулярная биология

Молекулярная биология Молекулярная биология Курс лекций для студентов IV курса факультета биологии РГПУ им. А.И. Герцена Профессор кафедры Зоологии, д.б.н., профессор Цымбаленко Надежда Васильевна ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА (1) лекция

Подробнее

МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ: история, методология, перспективы

МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ: история, методология, перспективы МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ: история, методология, перспективы Лекция 4 ОСНОВЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИИ РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА В ведение в генетическую инженерию: Учебное пособие для самостоятельной

Подробнее

ПРОГРАММА. дополнительного образования. по общей биологии для 11 класса. «Удивительная молекула ДНК»

ПРОГРАММА. дополнительного образования. по общей биологии для 11 класса. «Удивительная молекула ДНК» ПРОГРАММА дополнительного образования по общей биологии для 11 класса «Удивительная молекула ДНК» С середины ХХ века в области молекулярной биологии был сделан большой прорыв, который разгадал тайны главной

Подробнее

О. И. Кершанская. ошншм МИШ? ПРАКТИЧЕСКИЙ. п о д х о д. Учебное пособие

О. И. Кершанская. ошншм МИШ? ПРАКТИЧЕСКИЙ. п о д х о д. Учебное пособие О. И. Кершанская ошншм МИШ? ПРАКТИЧЕСКИЙ п о д х о д Учебное пособие Public Affairs Section, Small Grants Program US EMBASSY in KAZAKHSTAN Institute of Plant Biology and Biotechnology NATIONAL CENTER

Подробнее

Структурами, которые несут генетическую информацию, являются нуклеиновые кислоты

Структурами, которые несут генетическую информацию, являются нуклеиновые кислоты Организация наследственного материала (I) Вопросы: 1. Строение и функции нуклеиновых кислот. 2. Репликация ДНК. 3. Генетический код и его свойства. 4. Реализация генетической информации в клетке. Биосинтез

Подробнее

Разработка и коммерциализация спектро-секвенатора ДНК и РНК.

Разработка и коммерциализация спектро-секвенатора ДНК и РНК. Разработка и коммерциализация спектро-секвенатора ДНК и РНК. Более 50 лет назад Нобелевский лауреат Ричард Фейнман на лекции в Стэндфордском университете сказал то, что во многом справедливо и сегодня.

Подробнее

V. Термины и определения

V. Термины и определения V. Термины и определения 145. Для целей настоящего Приложения кроме терминов и определений, предусмотренных главой II настоящих Правил, используются также следующие основные понятия: адъювант - химическое

Подробнее

Решение биологических задач на тему «Генетический код. Биосинтез белка»

Решение биологических задач на тему «Генетический код. Биосинтез белка» Решение биологических задач на тему «Генетический код. Биосинтез белка» Типы задач 1. Определение последовательности аминокислот в фрагменте молекулы белка на основании последовательности нуклеотидов ДНК

Подробнее

Генетика ДИАГРАММА 01: Что такое ДНК? Каким образом ДНК кодирует белок? Глава 1: Гены и ДНК. Рекомендуемые фильмы

Генетика ДИАГРАММА 01: Что такое ДНК? Каким образом ДНК кодирует белок? Глава 1: Гены и ДНК. Рекомендуемые фильмы Генетика БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ И ДНК ГЕНЕТИКА Глава 1: Гены и ДНК Что такое ДНК? ДНК это длинная макромолекула внутри клетки, несущая в себе генетическую информацию о синтезируемых белках. Генетический код образован

Подробнее

Вирусология. Введение. Химия вирусов. Особенности структуры вирусных ДНК. Кольцевые перестановки и концевая избыточность в двуспиральных ДНК.

Вирусология. Введение. Химия вирусов. Особенности структуры вирусных ДНК. Кольцевые перестановки и концевая избыточность в двуспиральных ДНК. Вирусология Лектор профессор И.Г.Атабеков Программа курса: Введение. Краткие сведения об открытии вирусов. Две формы существования вирусов. Вирус покоящийся (вирусная частица) и внутриклеточный комплекс

Подробнее

4. Планируемые результаты обучения по дисциплине

4. Планируемые результаты обучения по дисциплине I Аннотация 1. Цель и задачи дисциплины Цель освоения дисциплины изучение основ генной, генетической, клеточной инженерии и молекулярного моделирования. Задачи освоения дисциплины: освоить терминологию,

Подробнее