ПРИКЛАДНАЯ МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ

Save this PDF as:
 WORD  PNG  TXT  JPG

Размер: px
Начинать показ со страницы:

Download "ПРИКЛАДНАЯ МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ"

Транскрипт

1 Министерство образования Республики Беларусь УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ «ГРОДНЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ ЯНКИ КУПАЛЫ» В.И. Резяпкин ПРИКЛАДНАЯ МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ Пособие по курсам «Молекулярная биология», «Основы молекулярной биологии», для студентов специальностей: Биология, Биоэкология Гродно 2011

2 УДК 54(075.8) ББК 24.1 Р34 Рекомендовано Советом факультета биологии и экологии ГрГУ им. Я. Купалы. Рецензенты: Заводник И.Б., доктор биологических наук, доцент; Буко В.У., доктор биологических наук, профессор. Р34 Резяпкин, В.И. Прикладная молекулярная биология : пособие / В.И. Резяпкин. Гродно : ГрГУ, с. ISBN В книге рассмотрены основные области практического применения достижений молекулярной биологии: ДНК-диагностика, ферменты и методы, используемые в генетической инженерии, способы получения рекомбинантных векторов, генетическая инженерия прокариот, эукариотические системы экспрессии чужеродных генов, способы получения и практическая значимость трансгенных растений и животных, достижения и перспективы генотерапии. Адресовано студентам специальностей: «Биология», «Биоэкология». ISBN УДК 54(075.8) ББК 24.1 Резяпкин В.И., 2011 Учреждение образования «Гродненский государственный университет» имени Янки Купалы, 2011

3 ВВЕДЕНИЕ Знания, полученные при изучении фундаментальных основ хранения, передачи и реализации генетической информации, на современном этапе развития науки нашли широкое применение в различных областях практической деятельности человека. С помощью методов, разработанных молекулярными биологами, созданы многочисленные живые организмы с измененным генетическим материалом, обладающие разнообразными полезными характеристиками. Разработаны многочисленные средства диагностики, широко применяемые в медицине, сельском хозяйстве, криминалистике и других сферах. Особый интерес представляют современные, основанные на принципах генотерапии, подходы профилактики и корректировки генетических заболеваний. В предлагаемой книге рассмотрены основные области практического применения достижений молекулярной биологии: ДНК-диагностика, ферменты и методы, используемые в генетической инженерии, способы получения рекомбинантных векторов, генетическая инженерия прокариот, эукариотические системы экспрессии чужеродных генов, способы получения и практическая значимость трансгенных растений и животных, достижения и перспективы генотерапии. Пособие написано в соответствии с учебной программой по курсу «Молекулярная биология» для студентов специальностей: «Биология», «Биоэкология» и является продолжением ранее изданного пособия: «Основы молекулярной биологии» / В.И. Резяпкин. Гродно: ГрГУ, с.

4 СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ А аденин АМФ аденозинмонофосфат АДФ аденозиндифосфат АТФ аденозинтрифосфат Г гуанин ГДФ гуанозиндифосфат ГМФ гуанозинмонофосфат ГТФ гуанозинтрифосфат дадф дезоксиаденозиндифосфат дамф дезоксиаденозинмонофосфат датф дезоксиаденозинтрифосфат дгдф дезоксигуанозиндифосфат дгмф дезоксигуанозинмонофосфат дгтф дезоксигуанозинтрифосфат дндф дезоксинуклеозиддифосфат ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота днмф дезоксинуклеозидмонофосфат днтф дезоксинуклеозидтрифосфат дтдф дезокситимидиндифосфат дтмф дезокситимидинмонофосфат дттф дезокситимидинтрифосфат дцдф дезоксицитидиндифосфат дцмф дезоксицитидинмонофосфат дцтф дезоксицитидинтрифосфат ирнк информационная РНК МГЭ мобильные генетические элементы мрнк матричная РНК НДФ нуклеозиддифосфат НК нуклеиновые кислоты НМФ нуклеозидмонофосфат НТФ нуклеозидтрифосфат П.н. пара нуклеотидов РНК рибонуклеиновая кислота ррнк рибосомная РНК Т тимин трнк транспортная РНК У урацил УДФ уридиндифосфат УМФ уридинмонофосфат УТФ уридинтрифосфат Ц цитозин цамф циклическая АМФ ЦМФ цитидинмонофосфат ЦДФ цитидиндифосфат ЦТФ цитидинтрифосфат А аденин АМФ аденозинмонофосфат АДФ аденозиндифосфат АТФ аденозинтрифосфат Г гуанин ГДФ гуанозиндифосфат ГМФ гуанозинмонофосфат ГТФ гуанозинтрифосфат дадф дезоксиаденозиндифосфат дамф дезоксиаденозинмонофосфат датф дезоксиаденозинтрифосфат дгдф дезоксигуанозиндифосфат дгмф дезоксигуанозинмонофосфат дгтф дезоксигуанозинтрифосфат дндф дезоксинуклеозиддифосфат ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота днмф дезоксинуклеозидмонофосфат днтф дезоксинуклеозидтрифосфат дтдф дезокситимидиндифосфат дтмф дезокситимидинмонофосфат дттф дезокситимидинтрифосфат дцдф дезоксицитидиндифосфат дцмф дезоксицитидинмонофосфат дцтф дезоксицитидинтрифосфат ирнк информационная РНК МГЭ мобильные генетические элементы мрнк матричная РНК НДФ нуклеозиддифосфат НК нуклеиновые кислоты НМФ нуклеозидмонофосфат НТФ нуклеозидтрифосфат П.н. пара нуклеотидов РНК рибонуклеиновая кислота ррнк рибосомная РНК Т тимин трнк транспортная РНК У урацил УДФ уридиндифосфат УМФ уридинмонофосфат УТФ уридинтрифосфат Ц цитозин цамф циклическая АМФ ЦМФ цитидинмонофосфат ЦДФ цитидиндифосфат ЦТФ цитидинтрифосфат

5 Глава 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК Определение первичной структуры (секвенирование) ДНК является сложнейшей процедурой, так как эта молекула имеет громаднейшие размеры. Например, у цветковых растений размер гаплоидного генома может достигать до п.н. Несмотря на это исследователи придают большое значение установлению последовательности нуклеотидов ДНК, поскольку информация о первичной структуре ее молекулы или ее фрагмента позволяет судить о ее непосредственной функции в живом организме. Определение первичной структуры ДНК осуществляют в несколько этапов. Этап 1. Фрагментация ДНК с помощью рестриктаз. В связи с тем, что в одном эксперименте можно определить последовательность ДНК, состоящую только из нескольких сотен пар нуклеотидов, ее молекулу предварительно фрагментируют. Для фрагментации ДНК обычно используют рестриктазы. Эти ферменты обладают специфичностью к первичной структуре ДНК и разрезают эту молекулу в строго определенных участках. При этом одна рестриктаза разрывает цепь ДНК в одних участках, другая в других местах. Для фрагментации используют, как минимум, две различные рестриктазы. В результате их действия образуются перекрывающиеся фрагменты (рис. 1.1). Этап 2. Определение нуклеотидных последовательностей перекрывающихся фрагментов. Существуют два принципиально отличающихся друг от друга подхода определения первичной структуры ДНК: химический метод, разработанный А.Максомом и В.Гилбертом, и ферментативный метод, предложенный Ф.Сангером. Последний метод наиболее распространен. Оба метода в настоящее время полностью автоматизированы, что значительно повысило эффективность определения первичной структуры ДНК.

6 Прикладная молекулярная биология Метод А.Максома и В.Гилберта (химический метод) Данный метод основан на специфическом химическом расщеплении полинуклеотидной цепи. В этом случае используются подходы, обеспечивающие выщепление определенного нуклеотида (либо по А, либо по Г, либо по Т, либо по Ц) и как следствие этого разрыв цепи ДНК. Определение первичной структуры ДНК осуществляют в 4 стадии. Рис Схема, иллюстрирующая фрагментацию ДНК с помощью рестриктаз Стадии 1. На этой стадии двухцепочечные ДНК разделяют с помощью денатурации. Затем в 5 -конец цепи ДНК вносят метку (рис. 1.2). Стадии 2. Анализируемый образец делят на 4 порции. Каждую порцию подвергают химической обработке, в результате ДНК распадается на фрагменты различной длины

7 Глава 1. Определение нуклеотидной последовательности ДНК (рис. 1.2) за счет статистического выщепления остатков Ц (порция 1), Т (порция 2), Г (порция 3), А (порция 4). В результате фрагментации образуются фрагменты как несущие метку, так и не несущие. В каждой порции образуется несколько меченых фрагментов, отличающихся друг от друга размером. Число таких меченых фрагментов будет равно числу нуклеотидов, по которым осуществлялось расщепление. Если в первой порции расщепление проводили по Ц, а таких нуклеотидов в анализируемой цепи два, то и меченых фрагментов образовалось также 2 (рис. 1.2). Стадии 3. На этой стадии проводят электрофорез полученных фрагментов (рис. 1.2). Скорость перемещения фрагментов обратно пропорциональна их длине. Чем короче фрагмент, тем с большей скоростью он перемещается. С помощью электрофореза можно разделить фрагменты, отличающиеся друг от друга на один нуклеотид. По окончанию электрофореза по длине перемещения определяют размер в данном эксперименте только меченных с 5 -конца фрагментов. Стадии 4. По результатам электрофореза меченых фрагментов определяют первичную структуру ДНК. В первой порции, где расщепление проводили по Ц, выявлено два меченных фрагмента, состоящих из трех и шести нуклеотидов. Поскольку расщепление цепи осуществляли за счет статистического выщепления Ц, то этот нуклеотид в анализируемой цепи будет занимать положение 4 и 7. Аналогично, по длине фрагментов, образующихся во 2-й порции, определяем положение Т в анализируемой цепи ДНК. Этот нуклеотид занимает 3 и 8 позиции. Подобным образом устанавливаем положения Г (6 и 10) и А (2, 5 и 9). Таким образом, устанавливается первичная структура неизвестной нуклеотидной последовательности ДНК.

8 Прикладная молекулярная биология Рис Установление первичной структуры ДНК с помощью метода А.Максома и В.Гилберта (химический метод). Для удобства на рисунке приведена первичная структура определяемого фрагмента. 1 стадия 1, 2 стадия 2, 3 стадия 3, 4 стадия 4 Метод Ф.Сангера (энзиматический метод) В его основе лежит принцип копирования анализируемой цепи ДНК с помощью ДНК-полимеразы. Этот фермент осуществляет наращивание цепи ДНК в результате присоединения очередного дезоксинуклеотида к 3 -гидро-

9 Глава 1. Определение нуклеотидной последовательности ДНК ксильной группе последнего дезоксинуклеотида. ДНКполимераза может использовать в качестве субстратов не только дезоксинуклеозидтрифосфаты, но и дидезоксинукл еозидтрифосфаты. У последних отсутствует гидроксильная группа в 3 -положении (рис. 1.3). Если в растущую цепь ДНК-полимераза включит дидезоксинуклеотид, то синтез ДНК обрывается, потому что в 3 -положении отсутствует гидроксильная группа, если же дезоксинуклеотид, то синтез ДНК может быть продолжен (рис. 1.4). Рис.1.3. У дидезоксинуклеозидтрифосфата в отличие от дезоксинуклеозидтрифосфата гидроксильная группа в 3 -положении При определении первичной структуры ДНК по данному методу образец ДНК разделяют на четыре порции. Во все порции добавляют: ДНК-полимеразу; днтф (датф, дттф, дцтф, дгтф); меченую затравку олигонуклеотид, комплементарный 3 -концу анализируемой цепи ДНК. Затем в первую порцию добавляют ддатф, во вторую ддттф, в третью ддцтф, в четвертую ддгтф. Рассмотрим события, происходящие в первой пробе (рис. 1.5). Затравка гибридизуется с участком ДНК анализируемой цепи в области ее 3 -конца. После этого ДНКполимераза будет включать в растущую цепь нуклеотиды в соответствии с принципом комплементарности. Напротив Т она может включить либо дамф, либо ддамф. Процесс включения является вероятностным. Если в растущую цепь ДНК включится ддамф, то синтез ДНК оборвется. Если же в растущую цепь ДНК включится дамф, то синтез ДНК будет продолжен. В результате в пробе будут содержаться

10 Прикладная молекулярная биология фрагменты вновь синтезированной цепи ДНК различной длины. При этом все они будут заканчиваться ддамф. После денатурации двухцепочечной ДНК с помощью электрофореза определяют длину вновь синтезированных фрагментов. Если длина фрагментов ДНК равна 13, 18 и 23 нуклеотидам, следовательно, в 13, 18 и 23 положении фрагмента будет находится А, а в анализируемой цепи Т. Аналогично определяют положение других нуклеотидов в анализируемой цепи ДНК. Таким образом, устанавливается первичная структура ДНК. Рис Если в растущую цепь ДНК-полимераза включит дидезоксинуклеотид, то синтез ДНК обрывется, если же дезоксинуклеотид, то синтез ДНК может быть продолжен 10

11 Глава 1. Определение нуклеотидной последовательности ДНК Рис Установление первичной структуры ДНК с помощью метода Ф. Сангера и Д. Коулсона (энзиматический метод). Для удобства на рисунке приведена первичная структура определяемого фрагмента. Этап 3. Установление первичной структуры ДНК посредством сопоставления перекрывающихся нуклеотидных последовательностей. После определения последовательности нуклеотидов фрагментов ДНК необходимо определить их очередность в интактной молекуле ДНК. Порядок их чередования устанав- 11

12 Прикладная молекулярная биология ливают на основании того, что фрагменты, полученные в результате разрезания разными рестриктазами, имеют идентичные фрагменты нуклеотидных последовательностей (рис. 1.6). Рис Установление первичной структуры ДНК посредством сопоставления перекрывающихся нуклеотидных последовательностей 12

13 Глава 2. СИНТЕЗ ДНК Химический синтез ДНК В настоящее время разработаны методы химического синтеза как одноцепочечных олигонуклеотидов, так и двухцепочечных ДНК. Синтез двухцепочечных ДНК осуществляют в два этапа. На первом этапе синтезируют одноцепочечные олигонуклеотиды с заданной последовательностью нуклеотидов. На втором этапе синтезированные олигонуклеотиды используются для конструирования протяженных двухцепочечных ДНК. Используя данный подход, можно синтезировать гены или другие последовательности ДНК, применяемые в генетической инженерии, биотехнологии, в ДНК-диагностике инфекционных и генетических заболеваниях, для идентификации личности и др. В настоящее время процедура химического синтеза ДНК автоматизирована. Приборы, в которых осуществляется синтез ДНК, называются ДНК-синтезаторами. Рассмотрим принцип метода, используемого для синтеза олигонуклеотидов (рис. 2.1). В начале этой процедуры первый мономер присоединяют к твердой фазе (нерастворимому носителю), который затем помещают в колонку-реактор. Далее через колонку пропускают второй мономер и другие химические реагенты. В результате второй мономер присоединяется к первому, образуя димер. Потом колонку промывают, с целью удаления непрореагировавших реагентов и побочных продуктов реакции. На этом завершается первый цикл. Затем осуществляют следующий цикл, пропуская через колонку очередной мономер. Циклы многократно повторяют до завершения синтеза олигонуклеотида с заданной первичной структурой. После завершения синтеза олигонуклеотид отделяют от твердой фазы и подвергают очистке. Полученные олигонуклеотиды могут быть использованы в качестве зондов при ДНКдиагностике, в качестве праймеров при секвенировании ДНК, а также для синтеза генов и др. 13

14 Прикладная молекулярная биология Рис Схема синтеза олигонуклеотида. N азотистое основание, 1 присоединение первого мономера к твердой фазе, 2 присоединение второго мономера, 3 присоединение третьего мономера, 4 отделение олигонуклеотида от твердой фазы Олигонуклеотиды могут быть использованы для синтеза двухцепочечных ДНК. Стратегии синтеза коротких и протяженных двухцепочечных ДНК отличаются. Для получения коротких двухцепочечных молекул (60 80 п.н.) вначале синтезируют комплементарные цепи, которые затем подвергают гибридизации (рис. 2.2). Рис Схема синтеза коротких двухцепочечных молекул ДНК 14

15 Глава 2. Синтез ДНК В случае синтеза более протяженных двухцепочечных ДНК (более 300 п.н.) применяют другие подходы. Необходимость их использования связана с тем, что при химическом синтезе олигонуклеотидов происходят ошибки, в результате которых синтез протяженного олигонуклеотида сопровождается крайне низким выходом. В связи с этим длинные двухцепочечные ДНК собирают из коротких одноцепочечных фрагментов, размер которых составляет нуклеотидов. Сборку двухцепочечных молекул ДНК из одноцепочечных фрагментов можно осуществлять разными способами. Один из способов подразумевает получение набора фрагментов с перекрывающимися концами (рис. 2.3). Нуклеотидные последовательности фрагментов подобраны таким образом, что после их гибридизации образуется двухцепоченая ДНК. Имеющиеся в ее молекуле одноцепочечные разрывы далее сшивают с помощью ДНК-лигазы. Другой подход, используемый для синтеза протяженных двухцепочечных ДНК, также подразумевает синтез набора фрагментов с перекрывающимися концами (рис. 2.4). Однако после гибридизации таких фрагментов в молекуле ДНК образуются большие бреши. Последние ликвидируются с помощью ДНК-полимеразы. Оставшиеся после работы ДНК-полимеразы разрывы сшиваются с помощью ДНКлигазы. 15

16 Прикладная молекулярная биология Рис Схема получения протяженных двухцепочечных ДНК, включающего синтез набора фрагментов с перекрывающимися концами. Нуклеотидные последовательности фрагментов подобраны таким образом, что после их гибридизации образуется двухцепоченая ДНК с разрывами, которые сшивают с помощью ДНК-лигазы Рис Схема получения протяженных двухцепочечных ДНК, включающего синтез набора фрагментов с перекрывающимися концами. Нуклеотидные последовательности фрагментов подобраны таким образом, что после их гибридизации образуется двухцепоченая ДНК с брешами. Последние ликвидируются с помощью ДНК-полимеразы. Оставшиеся после работы ДНКполимеразы разрывы сшиваются с помощью ДНК-лигазы 16

17 Глава 2. Синтез ДНК Полимеразная цепная реакция (ПЦР) Суть метода ПЦР заключается в многократном копировании определенного участка ДНК. В течение нескольких часов с помощью этого метода можно получить более 50 млрд. копий специфических нуклеотидных последовательностей (рис. 2.5). Этот метод широко используют для синтеза генов. Однако только этим применение ПЦР не ограничивается. Рис В результате ПЦР можно получить множество копий специфических последовательностей ДНК При проведении ПЦР в реакционную смесь добавляют следующие компоненты: ДНК-матрицу, содержащую тот участок ДНК (ДНКмишень), который требуется амплифицировать; праймеры искусственно синтезированные олигонуклеотиды (15 30 нуклеотидов), комплементарные концевым участкам ДНК-мишени и способные с ними образовывать гибриды (рис. 2.6); Tag-полимераза термостабильная ДНК-полимераза, катализирующая реакцию полимеризации ДНК и выдерживающая нагревание до 95 С; днтф (датф, дгтф, дцтф, дттф) субстраты для синтеза ДНК. 17

18 Прикладная молекулярная биология Рис Праймеры олигонуклеотиды, комплементарные концевым участкам ДНК-мишени. После плавления ДНК и последующего отжига они способны с последними образовывать гибриды. Р 1 и Р 2 праймеры При проведении ПЦР осуществляют многократное повторение циклов, каждый из которых состоит из трех стадий: денатурация, отжиг и элонгация. Рассмотрим подробнее эти стадии. Денатурация. На этой стадии реакционную смесь, содержащую все компоненты, необходимые для ПЦР, нагревают до С, в результате происходит плавление ДНК и ее цепи расходятся (рис. 2.7). Отжиг. Реакционную смесь охлаждают приблизительно до 55 С, при этом праймеры гибридизуются с комплементарными последовательностями ДНК (рис. 2.7). Элонгация. Температуру реакционной смеси на этой стадии повышают приблизительно до 75 С, поскольку активность Tag-полимеразы в таких условиях оптимальна. ДНК-полимераза, используя праймер в качестве затравки, осуществляет синтез комплементарной цепи ДНК (рис. 2.7). На рис. 2.7 показаны события, происходящие на первом цикле ПЦР. Как видно из рисунка после первого 18

19 Глава 2. Синтез ДНК цикла длина каждой из синтезированных цепей ДНК больше длины нуклеотидной последовательности ДНК-мишени. Таким образом, на этой стадии не происходит образования первой копии фрагмента ДНК, который требуется получить в результате амплификации. Рис События, происходящие на первом цикле ПЦР. Р 1 и Р 2 праймеры Первая же копия фрагмента амплификации образуется только после третьего цикла ПЦР (рис. 2.8). Для получения большого количества копий фрагмента амплификации цикл повторяется раз. На рис. 2.9 показаны события, осуществляющиеся при протекании поздних циклов ПЦР. В это время в реакционной смеси содержатся главным образом фрагменты ДНК, являющиеся копиями ДНК-мишени. Каждый цикл длится около 3 5 мин. К концу 30 цикла число копий превышает ПЦР является высокочувствительным методом, позволяющим при наличии ничтожного количества ДНК в пробе получить огромное число копий интересующих исследователя фрагментов ДНК. 19

20 Прикладная молекулярная биология Рис Первая копия фрагмента амплификации образуется после третьего цикла ПЦР. Р 1 и Р 2 праймеры ПЦР в настоящее время широко используют для проведения различных видов анализа. Во многих случаях в анализируемых образцах требуется выявить наличие определенных последовательностей ДНК. Например, при идентификации патогенных микроорганизмов в биологических объектах достаточным является выявление ДНК этого возбудителя в исследованных образцах. С этой целью может быть использован ПЦР-анализ. ПЦР-анализ проводят в три стадии. На первой стадии осуществляют подготовку образцов ДНК. Они могут быть выделены из любого биологического объекта. На второй стадии осуществляют амплификацию специфических нуклеотидных последовательностей. В этом случае необходимо использовать праймеры, комплементарные к искомой ДНК. Если в исследуемом образце присутствует искомая ДНК, то праймеры в процессе отжига будут с 20

21 Глава 2. Синтез ДНК ней гибридизоваться и Tag-полимераза сможет начать синтез ДНК. Тогда в результате ПЦР будут синтезированы многочисленные копии фрагмента амплификации. При отсутствии искомой ДНК в исследуемых образцах праймеры не будут гибридизоваться с ДНК и не смогут выступать в качестве затравки для полимеразы. Синтез ДНК не будет осуществляться. На третьей стадии посредством электрофореза в агарозном геле выявляют наличие или отсутствие в реакционной смеси продукта амплификации (рис. 2.10). При наличии продукта амплификации делается заключение о том, что в исследуем образце присутствует искомая ДНК. Рис При протекании поздних циклов ПЦР в реакционной смеси содержатся главным образом фрагменты ДНК, являющиеся копиями ДНК-мишени. Р 1 и Р 2 праймеры 21

22 Прикладная молекулярная биология Рис Выявление наличия или отсутствия в реакционной смеси продукта амплификации посредством электрофореза в агарозном геле. Стрелкой указано направление электрофореза. 1 положительный контроль, 2 отрицательный контроль, 3 отрицательный образец, 4 положительный образец ПЦР-анализ нашел и находит применение в различных областях: при диагностике инфекционных, генетических и онкологических заболеваний, диагностике патогенов в пищевых продуктах, диагностике генетически модифицированных продуктов, идентификации личности и т.д. При диагностике инфекционных заболеваний используются праймеры, специфичные к участкам ДНК потенциального возбудителя, но не пациентов. При наличии ДНК возбудителя в биологических образцах, полученных от больного, ПЦР-анализ даст положительный результат, при отсутствии такой ДНК отрицательный. Таким образом, на основании ПЦР-анализа можно сделать вывод о причине заболевания. ПЦР-анализ позволяет выявить возбудителя заболевания в очень низкой концентрации. Соответственно, при диагностике генетических и онкологических болезней используются праймеры, специфичные к генам, обуславливающим данные заболевания. А при диагностике патогенов в пище используются праймеры, специфичные к ДНК патогенов. 22

23 Глава 2. Синтез ДНК ПЦР с обратной транскрипцией Геномы многих вирусов представлены РНК. В их жизненных циклах может отсутствовать промежуточная фаза превращения РНК в ДНК. В связи с этим при выявлении РНК таких вирусов ее необходимо перевести в форму ДНК. Для этого используют термостабильную обратную транскриптазу (ревертазу) фермент, использующий в качестве матрицы одноцепочечную РНК для синтеза двухцепочечной ДНК. При проведении обратной транскрипции в реакционной среде должны присутствовать праймеры и днтф. После обратной транскрипции полученная комплементарная ДНК (кднк) может быть амплифицирована с помощью ПЦР (рис. 2.11). Рис ПЦР с обратной транскрипцией Рассмотренный выше метод может быть применен также для синтеза кднк при использовании в качестве матрицы ирнк или других типов РНК. 23

24 Прикладная молекулярная биология ПЦР в реальном времени ПЦР в реальном времени позволяет осуществлять детекцию продуктов амплификации во время проведения эксперимента. Этот метод исключает стадию электрофореза, что способствует существенному сокращению продолжительности эксперимента. Накопление продуктов ПЦР пропорционально числу копий исследуемой ДНК (или РНК) в анализируемом образце. В связи с этим возможно количественное определение ДНК или РНК. Существует множество подходов регистрации продуктов амплификации в процессе ПЦР. Рассмотрим один из таковых, получивший название «Выщепление 5 -концевой метки» (рис. 2.12). При использовании этой методики в реак-ционную смесь добавляют ДНК-зонды, содержащие на 5 -конце флуоресцентную метку (флуорофор), а на 3 -конце гаситель флуоресценции. ДНК-зонды комплементарны участку амплификации. В ходе ПЦР на стадии отжига ДНКзонды присоединяются к участку амплификации. В таком состоянии гаситель поглощает излучение, испускаемое флуоресцентной меткой. На стадии элонгации ДНК-полимераза, используя праймер в качестве затравки, начинает синтез комплементарной цепи ДНК в направлении ДНКзонда. При его достижении благодаря 5 -экзонуклеазной активности этот фермент выщепляет флуорофор. В результате происходит разъединение флуоресцентной метки и гасителя, что сопровождается свечением. Интенсивность свечения с каждым циклом ПЦР будет усиливаться. В то же время интенсивность свечения будет зависеть и от числа копий анализируемых ДНК в образце. Чем интенсивнее свечение, тем больше число копий. Таким образом, по интенсивности свечения можно судить о количественном содержании анализируемой ДНК в исследуемых пробах. 24

25 Глава 2. Синтез ДНК Рис Регистрация продуктов амплификации в процессе ПЦР в реальном времени при использовании методики «Выщепление 5 -концевой метки» 25

26 Глава 3. ДНК-ДИАГНОСТИКА Первичная структура ДНК индивидуумов, относящихся к одному или различным видам живых существ, в определенной степени уникальна. На этой особенности основана ДНК-диагностика. Последняя включает группу методов, позволяющих установить истину в результате исследования ДНК. Сегодня ДНК-диагностика нашла широкое применение при выявлении возбудителей инфекционных заболеваний, обнаружения генетических заболеваний, установлении биологического родства, идентификации личности и т.д. Образцы ДНК для исследования могут быть выделены из любого биологического материала: из крови, волоса, мочи, мокроты, соскоба с внутренней стороны щеки или мочеиспускательного канала и т. п. Оказываются пригодными для ДНК-диагностики биологические образцы, сохраняющиеся в течение сотен и тысяч лет. Количество ДНК, необходимое для проведения анализа может быть ничтожно малым. Возможно успешная диагностика, даже если в образце имеется только одна молекула ДНК. ДНК-диагностика является не только чрезвычайно чувствительным методом, но высокоточным. Ее точность приближается к 100 %. При ДНК-диагностике широко используется метод ПЦР. Его принцип и применение были рассмотрены в предыдущей главе. ПЦР может быть применен при анализе ДНК в сочетании с другими подходами. Об этом поговорим подробнее в следующих разделах. В то же время многие диагностические методы основаны на использовании меченых гибридизационных зондов, комплементарных к искомой молекуле ДНК. ДНК-диагностика с использованием меченых гибридизационных зондов Этот метод основан на использовании гибридизационных зондов, комплементарных к искомым последовательностям ДНК. В зависимости от ситуации зонды могут быть представлены молекулами ДНК или РНК. Они 26

27 Глава 3. ДНК-диагностика могут быть длинными (более 100 нуклеотидов) или короткими (менее 50 нуклеотидов). Они могут представлять собой продукт химического синтеза или являться клонированными копиями интактных генов или их фрагментов. Гибридизационный зонд должен быть высокоспецифичным, т.е. он должен спариваться только с искомой нуклеотидной последовательностью. Кроме того зонд должен содержать радиоактивную (или нерадиоактивную) метку. Последовательность действий при данном методе диагностики следующая (рис. 3.1): получение образца ДНК из биологического объекта; денатурация ДНК; фиксация одноцепочечной ДНК-мишени на мембранном фильтре; нанесение на фильтр меченого одноцепочечного ДНКзонда, который при определенных условиях гибридизуется с ДНК-мишенью; промывание фильтра для удаления избытка не связавшейся меченой ДНК-зонда; детекция гибридных молекул зонд/мишень. Рис ДНК-диагностика с использованием меченых гибридизационных зондов 27

28 Прикладная молекулярная биология Выявление на последней стадии эксперимента гибридных молекул зонд/мишень свидетельствует о наличии искомой ДНК в исследуемой пробе. Об отсутствии таковой ДНК в анализируемой пробе позволяет судить отрицательный результат детекции. Таким образом, с помощью меченого зонда можно выявить (или не выявить) определенные последовательности ДНК в образце и на основании этого сделать соответствующий вывод. В качестве гибридизационных зондов часто используют зонды, меченные радиоактивным изотопом 32 Р. Такие зонды обладают высокой удельной радиоактивностью и в связи с этим легко детектируются. Радиоактивную метку на фильтре после удаления несвязавшегося зонда выявляют с помощью радиоавтографии. Однако, радиоактивно меченые зонды несут определенную экологическую опасность. По этой причине в настоящее время все чаще используют зонды, меченные другим способом. Нашли широкое применение зонды, меченые биотином. Последовательность действий при использовании таких зондов следующая (рис. 3.2): гибридизация зонда, меченного биотином, с ДНКмишенью; удаление промыванием избытка несвязавшегося зонда; добавление авидина (белка куриного яйца) или стрептавидин (бактериальный аналог авидина), эти белки имеют несколько центров сродства к биотину, и благодаря им связываются с биотинилированным зондом; добавление связанного с биотином фермента. Обычно для этих целей используют щелочную фосфатазу или пероксидазу хрена. Биотинилированный фермент связывается с сайтом связывания биотина, расположенном в молекуле стрептавидина (или авидина); добавление субстрата, который под действием используемого фермента превращается в окрашенный или хемилюминесцентный продукт; регистрация изменения окраски либо люминесценции. Нерадиоактивные зонды не только более экологичны, чем радиоактивные, но и более стабильны. Долговечность 28

29 Глава 3. ДНК-диагностика зондов меченных 32 Р ограничена быстрым распадом радиоактивного изотопа, период полураспада 32 Р составляет 14,3 суток. Биотинилированные же зонды стабильны не менее чем год. В то же время нерадиоактивные зонды по чувствительности не уступают радиоактивным. Рис ДНК-диагностика с использованием гибридизационного зонда, меченого биотином. Б биотин, С стрептавидин, ЩФ щелочная фосфатаза Еще одним методом нерадиоактивной детекции является подход, основанный на использовании зонда «молекулярного маяка» (рис. 3.3). Этот зонд состоит из нескольких десятков нуклеотидов. Нуклеотиды, расположенные во внутренней части зонда, комплементарны ДНК-мишени. Нуклеотиды же, находящиеся на концах зонда, взаимно комплементарны и образуют шпильку. К 5 -концу зонда присоединен флуорофор, испускающий излучение, а к 3 -концу тушитель, поглощающий испускаемое флуорофором излучение. После гибридизации зонда «молекулярного маяка» с ДНК-мишенью, происходит пространственное разобщение флуорофора и тушителя, и зонд начинает испускать свет. Испускаемое свечение свидетельствует о том, что между зондом и ДНК-мишенью произошла гибридизация (рис. 3.3). 29

30 Прикладная молекулярная биология Рис В результате гибридизации зонда «молекулярного маяка» с ДНК-мишенью наблюдается флуоресценция ДНК-фингерпринтинг ДНК-фингерпринтинг (или геномная дактилоскопия) применяется для генетической идентификации личности, установления отцовства и в криминалистике. Последовательность процедур при использовании метода ДНК-фингерпринтинга следующая: подготовка образца крови или ткани; выделение ДНК из образца; фрагментация ДНК рестриктазой; электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле; перенос ДНК из геля на мембрану; гибридизация на мембране ДНК с одним или несколькими зондами, комплементарными определенным нуклеотидным последовательностям. В качестве зондов обычно используют минисателлитные ДНК; отмывка избытка меченого зонда; выявление полос гибридизации; анализ полученного результата. 30

31 Глава 3. ДНК-диагностика Распределение гибридизационных полос, полученных с использованием метода ДНК-фингерпринтинга, у различных индивидуумов различно (рис. 3.4), но для разных тканей одного и того же индивидуума, оно остается постоянным и не зависит от возраста. В связи с этим данный метод может быть использован для создания ДНК-паспортов, которые представляют собой спектр распределения гибридизационных полос, полученный рассмотренным выше методом. Этот спектр остается постоянным на протяжении всей жизни, поэтому ДНК-паспорт нельзя потерять и его нельзя подделать. Рис Распределение гибридизационных полос, полученных с использованием метода ДНК-фингерпринтинга, у различных индивидуумов, 1, 2, 3 образцы ДНК, полученные от различных индивидуумов ДНК-фингерпринтинг используется в судебной медицине для идентификации личности. Сравнивая полученные методом ДНК-фингерпринтинга результаты анализа ДНК подозреваемого и ДНК, выделенной из биологических образцов (крови, спермы, кусочка кожи, волос и т.д.) с места преступления, можно сделать вывод о причастности подозреваемого к преступлению (рис. 3.5). Если спектры гибридизационных полос при анализе ДНК подозреваемого 31

32 Прикладная молекулярная биология и ДНК образцов с места преступления совпадают, то можно с высокой долей вероятности судить о причастности подозреваемого к преступлению. Если же спектры не совпадают, то эти данные свидетельствуют о непричастности подозреваемого к преступлению. Рис Распределение гибридизационных полос, полученных с использованием метода ДНК-фингерпринтинга, при анализе ДНК, выделенной из биологического образца с места преступления (БО) и из тканей подозреваемого 1 (П 1 ) и подозреваемого 2 (П 2 ). Совпадение спектра гибридизационных полос, выявленных при анализе ДНК из образца с места преступления, с таковым подозреваемого 2 свидетельствует о причастности его к преступлению. Отличие спектра гибридизационных полос, выявленных при анализе ДНК из образца с места преступления, от такового подозреваемого 1 свидетельствует о его непричастности к преступлению ДНК-фингерпринтинг может быть применен для установления отцовства. Поскольку распределение полос гибридизации наследуется по законам Менделя, то потомки от матери и отца наследуют по половине полос. Сравнивая полученные результаты ДНК-анализа предполагаемого отца, матери и ребенка можно определить является ли предполагаемый отец биологическим отцом или нет (рис. 3.6). 32

33 Глава 3. ДНК-диагностика Рис Распределение гибридизационных полос, полученных с использованием метода ДНК-фингерпринтинга, при анализе ДНК матери (М), ребенка (Р) и двух предполагаемых отцов. Из анализа результатов следует, что ребенок унаследовал половину полос от матери и половину полос от П1. Следовательно, он и является биологическим отцом Диагностика инфекционных заболеваний В настоящее время зонды широко используются для диагностирования инфекционных заболеваний. В качестве зондов, используются нуклеотидные последовательности, комплементарные к ДНК возбудителя, но не к ДНК человека или к ДНК организмов, которые могут присутствовать в биообразцах взятых для ДНК-диагностики. При этом предпочтительно использовать зонды, комплементарные к высокоповторяющимся последовательностям ДНК возбудителя, что значительно повышает чувствительность метода диагностирования. Получены и охарактеризованы более сотни ДНК-зондов, позволяющих идентифицировать патогенные штаммы различных бактерий, вирусов и паразитических простейших. ДНК-диагностика генетических заболеваний ДНК-диагностика генетических болезней позволяет на уровне ДНК идентифицировать ту или иную патологию. На основании ДНК-теста можно сделать вывод о том, 33

34 Прикладная молекулярная биология что причиной заболевания являются или не являются нарушения в организации ДНК. Многие наследственные заболевания проявляются не сразу, а по прошествии довольно продолжительного времени. ДНК-диагностика же позволяет выявить болезнь, когда еще признаки заболевания не проявились. В связи с этим ДНК-диагностика в раннем возрасте позволит заблаговременно предпринять определенные меры при лечении данного заболевания. Кроме того, используя ДНК-диагностику, можно выявить носителей «дефектных» генов, и в последствие на основании диагноза планировать семью. Возможна ДНК-диагностика до рождения. В этом случае ДНК плода выделяют из хориона, пуповины или омниотической жидкости. Более того, возможна преимплантационная ДНК-диагностика. В этом случае яйцеклетки оплодотворяют in vitro. Из зародыша на стадии 8 клеток извлекают 1 или 2 клетки и анализируют их ДНК на наличие поврежденного гена. Зародыш, содержащий неповрежденный ген, имплантируют в матку. Гены, вызывающие генетические заболевания, отличаются от нормальных генов первичной структурой. Причиной генетического заболевания может являться также и нарушение в регуляции экспрессии генов или же отсутствие самих генов. Обнаружить такие заболевания можно, выявив отличия в организации дефектного гена от нормального. ДНК-диагностика генетических заболеваний с использованием гибридизационных зондов Диагностировать генетические заболевания можно с помощью гибридизационных зондов. С этой целью из клеток больного выделяют ДНК. Затем ее фрагментируют, используя рестриктазу. Полученные фрагменты разделяют с помощью электрофореза. Далее фрагменты переносят на нитроцеллюлозный фильтр. На фильтр наносят зонд, несущий радиоактивную метку. В качестве зонда могут быть использованы последовательности ДНК, комплементарные дефектному или нормальному гену. Зонд при наличии комплементарных последовательностей в исследуемой ДНК, 34

35 Глава 3. ДНК-диагностика гибридизуется с ней, при отсутствии не гибридизуется. После отмывки не связавшегося зонда методом авторадиографии выявляют наличие полосы гибридизации. Если при использовании зонда, комплементарного к дефектному гену, полоса гибридизации не выявляется (рис. 3.7), это свидетельствует об отсутствии дефектного гена в исследуемом образце ДНК пациента. На основании этих результатов, можно сделать вывод о том, что у пациента не обнаружено диагностируемое генетическое заболевание. Если же гибридизационная полоса выявляется, то делается вывод о том, что пациент является носителем дефектного гена. Рис Идентификация генетического заболевания с помощью гибридизационного зонда, комплементарного дефектному (но не нормальному) гену. Наличие полосы гибридизации при анализе образца ДНК свидетельствует о том, что пациент, у которого был взят образец ДНК (1), является носителем дефектного гена. Отсутствие полосы гибридизации свидетельствует о том, что пациент, у которого был взят образец ДНК (2), не является носителем дефектного гена Гибридизацию меченого зонда с ДНК можно проводить на хромосомных препаратах. В этом случае меченый зонд наносят на препараты специально приготовленных метафазных хромосом. После отмывки не связавшегося зонда выявляют места локализации последовательностей ДНК, комплементарных используемому зонду. Выявление таких мест осуществляют в случае использования радиоактивной 35

36 Прикладная молекулярная биология метки, посредством нанесения светочувствительной эмульсии на препараты хромосом, при использовании же биотинмеченных или флюоресцирующих ДНК-зондов посредством проведения соответствующей обработки препаратов. ДНК-диагностика серповидноклеточной анемии Серповидноклеточная анемия генетическое заболевание, причиной которого является замена одного нуклеотида в β-глобиновом гене (А заменяется на Т). В результате такой замены мутантный гемоглобин перестает эффективно транспортировать кислород. С заменой одного нуклеотида в β-глобиновом гене связано исчезновение сайта узнавания для рестриктазы Cvn1. Этот фермент распознает нуклеотидную последовательность CCTGAGG, которая в результате мутации превращается в последовательность ССТGTGG. Последнюю указанная рестриктаза не способна узнавать, и соответственно, не способна разрезать ДНК в этом участке. В процессе ДНК-анализа на наличие мутантных генов с помощью ПЦР амплифицируют фрагмент β-глобинового гена (рис. 3.8). Такой фрагмент нормального гена содержит 3 сайта узнавания рестриктазы Cvn1, мутантного же на один меньше, т.е. 2 сайта. Амплифицированные фрагменты на следующей стадии обрабатывают рестриктазой Cvn1, в результате фрагмент, амплифицированный с нормального гена, расщепляется на 4 более мелких фрагмента ДНК, а фрагмент, амплифицированный с мутантного гена, на 3 (рис. 3.8). Продукты рестрикции далее разделяют с помощью электрофореза. На электрофореграмме после окраски ДНК определяют число полос. Если анализировалась ДНК индивидуума, гомозиготного по нормальному гену (АА), то на электрофореграмме будут выявлены 4 полосы. При анализе ДНК индивидуума, гомозиготного по мутантному гену (SS), на электрофореграмме будут обнаружены 3 полосы. В случае же анализа ДНК индивидуумов, гетерозиготных по данному гену (АS), на электрофореграмме будут выявлены 5 полос (рис. 3.8). 36

37 Глава 3. ДНК-диагностика Рис ДНК-анализ, направленный на выявление мутантного β-глобинового гена. АА гомозиготность по нормальному β-глобиновому гену, SS гомозиготность по мутантному β-глобиновому гену, АS гетерозиготность 37

38 Прикладная молекулярная биология Обнаружение однонуклеотидных замен с использованием методов ПЦР и лигирования олигонуклеотидных зондов (ПЦР/ЛОЗ) Метод ПЦР/ЛОЗ используется для идентификации мутантного гена, отличающегося от нормального гена заменой одной пары нуклеотидов. Предположим, что нормальный ген отличается от мутантного тем, что в определенном участке вместо пары АТ в нормальном гене в мутантном гене находится ГЦ-пара. При анализе методом ПЦР/ЛОЗ с помощью ПЦР амплифицируют фрагмент исследуемого гена, содержащий пару нуклеотидов, по кото-рой отличается нормальный и мутантный ген (рис. 3.9). Рис Амплификация методом ПЦР фрагментов нормального и мутантного генов, отличающихся одной парой нуклеотидов Полученные в результате амплификации фрагменты гибридизуют с двумя зондами (рис. 3.10). При отжиге этих зондов с фрагментом нормального гена происходит их полная гибридизация. При этом 3 -конец зонда-1 гибридизуется с нуклеотидом (Т), который в мутантном гене заменен на Ц. А 5 -конец зонда-2 образует комплементарное взаимодействие с нуклеотидом, примыкающим к Т. В случае фрагмента мутантного гена 3 -концевой нуклеотид зонда-1 оказывается не комплементарным нуклеотиду Ц (рис. 3.10). К зонду-1 присоединен биотин, а к зонду-2 диго- 38

39 Глава 3. ДНК-диагностика ксигенин. При добавлении ДНК-лигазы в пробу, содержащую фрагмент нормального гена, зонды-1 и 2 ковалентно сшиваются. В то время как при добавлении ДНК-лигазы в пробу, содержащую фрагмент мутантного гена, этого не происходит, т.к. 3 -концевой нуклеотид зонда-1 оказывается не комплементарным соответствующему нуклеотиду (рис. 3.10). После обработки лигазой проводят денатурацию ДНК, в результате которой происходит высвобождение зондов. Затем содержимое проб переносят в пластиковые лунки, покрытые стрептавидином. С последним связываются меченные биотином зонды (рис. 3.10). После связывания лунки промывают с целью удаления не связавшегося материала. Затем в них добавляют соединенные со щелочной фосфатазой антитела к дигоксигенину. Антитела при наличии дигоксигенина взаимодействуют с ним, образуя комплекс, содержащий в своем составе щелочную фосфатазу (рис. 3.10). Для удаления не связавшегося материала лунки снова промывают. После этой процедуры в них добавляют субстрат. При наличии щелочной фосфатазы субстрат превращается в окрашенный продукт (рис. 3.10). Появление окраски в лунке свидетельствует о связывании антитела с зондом, меченным дигоксигенином, и, следовательно, о том, что произошло лигирование зонда-1 и зонда-2. На основании этих данных можно сделать вывод о том, что анализу в этом случае подвергся нормальный ген. Если же окрашивания не произошло (рис. 3.10), значит, лигирования не было. Анализу в этом случае подвергся мутантный ген. Метод ПЦР/ЛОЗ является высокоэффективным и высокоспецифичным методом. Все его стадии автоматизированы. 39

40 Прикладная молекулярная биология Рис Идентификации мутантного гена, отличающегося от нормального гена заменой одной пары нуклеотидов метод ПЦР/ЛОЗ. Б биотин, Д дигоксигенин, АТ антитело, ЩФ щелочная фосфатаза 40

41 Глава 3. ДНК-диагностика Идентификация мутаций в разных участках одного гена с помощью нескольких гибридизационных зондов Многие генетические заболевания связаны с мутациями в разных участках одного и того же гена. Такие мутантные гены отличаются от нормального гена и между собой нуклеотидными заменами в определенных сайтах. В свою очередь от комбинации мутантных и нормальных генов в геноме индивидуумов зависит проявление генетического заболевания. В связи с этим крайне важным для коррекции патологии является установление генетического статуса больного. С целью идентификации в разных сайтах гена мутаций синтезируют набор специфических зондов, каждый из которых комплементарен фрагменту гена, несущему известную мутацию. К 3 -концу каждого зонда присоединяют poly(dt) (около 400 нуклеотидов), с помощью которых ДНКзонды связываются с определёнными точками на мембране (рис. 3.11). Далее амплифицированные с помощью ПЦР и помеченные биотином фрагменты анализируемого гена (каждый из которых содержит по одному мутантному сайту) гибридизуют с зондами, пришитыми к мембране (рис. 3.11). Затем добавляют стрептавидин, связанный с ферментом (щелочной фосфатазой или пероксидазой хрена). Там, где произошла гибридизация фрагмента мутантного гена с зондом, стрептавидин связывается с биотином, образуя комплекс, состоящий из зонда, фрагмента мутантного гена, биотина, стрептавидина и фермента (рис. 3.11). Мембрану промывают, и добавляют неокрашенный субстрат, который под действием фермента превращается в окрашенный продукт (рис. 3.11). На точке фильтра, где наблюдается окрашивание, имеет место соответствие между амплифицированным фрагментом мутантного гена и специфическим зондом. Что свидетельствует о наличии соответствующего мутантного сайта в анализируемом гене. Таким образом, проанализировав результаты эксперимента, можно идентифицировать наличие мутантных сайтов в гене. 41

42 Прикладная молекулярная биология Рис Идентификация мутаций в разных участках одного гена. Б биотин, С стрептаведин, ЩФ щелочная фосфатаза Идентификация биологических останков с использованием молекулярно-генетического анализа с целью выявления их принадлежности к определенной семье Идентификацию костных останков с целью установления их принадлежности к определенной семье можно проводить в 3 этапа: установление половой принадлежности останков; выявление генетического родства между индивидуумами, останки которых исследуются; 42

43 Глава 3. ДНК-диагностика установление принадлежности выявленных генетически родственных индивидуумов к определенной семье. Рассмотрим подробнее все эти этапы. Предположим, что поставлена задача проанализировать костные останки десяти человек: выявить их половую пренадлежность, установить или опровергнуть генетическое родство между индивидуумами, останки которых обнаружены, и установить принадлежность выявленных генетически родственных индивидуумов к определенной семье. Определение половой принадлежности останков может быть осуществлено по анализу организации гена амелогенина белка зубной эмали. Этот ген локализован в половых хромосомах X и Y. Ген амелогенина в Y-хромосоме оказывается на 6 п.н. длиннее, чем в X-хромосоме. После выделения ДНК из костных останков получают с помощью ПЦР фрагменты генов амелогенина. При этом фрагмент гена Y-хромосомы состовляет 112 п.н., а Х-хромосомы 106 п.н. Поскольку у мужчин присутствуют X и Y хромосомы, то в результате ПЦР образуются оба фрагмента. У женщин присутствует только X хромосома, поэтому у них образуется только один фрагмент, размером 106 п.н. Длину фрагментов определяют с помощью электрофореза. Результаты исследования десяти гипотетических останков представлены на рис Они свидетельствуют о том, что останки принадлежат четырем мужчинам и шести женщинам. Рис Установление половой принадлежности костных останков на основе определения длины фрагмента гена амелогенина 43

44 Прикладная молекулярная биология Для выявления генетического родства обычно используют локусы ДНК, находящиеся в 5 и более аллельных состояниях. С этой целью может быть использован локус (ТН01), имеющий 5 аллельных состояний, в которых динуклеотид ЦА повторяется от 6 до 10 раз: (ЦА)6, (ЦА)7, (ЦА)8, (ЦА)9, (ЦА)10. В составе генома каждого человека могут присутствовать из всех возможных только 1 или 2 аллельных локуса. Аллели легко различить по размерам ПЦР-фрагментов, определяемых с помощью электрофореза (рис. 3.13). Наличие двух полос на электрофореграмме указывает на гетерозиготное состояние локуса, одной гомозиготного. Сравнивая распределение фрагментов ДНК на электрофореграмме, можно сделать вывод о возможном родстве (или опровергнуть его) по вертикали (родитель ребенок). У ребенка размер одного фрагмента должен совпадать с размером одного из фрагментов матери, а размер другого с одним из фрагментов отца. Если у индивидуумов отсутствуют одинаковые полосы, то они родственниками по вертикали не являются, а если таковые присутствуют, то родство по вертикали возможно. Об отсутствии родства по вертикали (если отсутствуют одинаковые аллели локуса) можно судить со 100 %-й вероятностью. О наличие же родства по вертикали (при наличии одинаковых аллелей локусов) можно говорить с определенной вероятностью. Поэтому для установления родства по вертикали с высокой долей вероятности, как правило, анализируют картины распределения аллелей нескольких полиморфных локусов. На рис представлен анализ аллельного состояния локуса ТН01 в составе ДНК десяти гипотетических останков. Внимательно рассмотрев электрофореграмму, можно сделать вывод о том, что индивидуумы 3 и 7 по отдельности являются возможными родственниками по вертикали индивидуумам 4, 5 и 6. В то же время индивидуумы 3 и 7 между собой не являются родственниками по вертикали. На основании этих результатов с определенной долей вероятности можно полагать, что индивидуум 3 является отцом, индивидуум 7 матерью, а индивидуумы 4, 5 и 44

45 Глава 3. ДНК-диагностика 6 дочерьми. Таким образом, результаты анализа позволили выявить семейную группу. На следующем этапе необходимо идентифицировать ее. С этой целью нужно сравнить ДНК представителей этой семейной группы с ДНК предполагаемых родственников. Для этого можно использовать различные подходы. Одним из таких подходов является исследование митохондриальной ДНК. Известно, что митохондриальная ДНК передается потомкам по материнской линии. В связи с этим сравнение первичной структуры митохондриальной ДНК членов семейной группы с таковой предполагаемых родственников по материнской линии позволит идентифицировать семейную группу. Рис Анализ аллельного состояния локуса ТН01 в составе ДНК десяти гипотетических останков. Внизу показана идентифицированная на основе анализа семейная группа. П отец, М мать, Д дочь 45

46 Глава 4. ФЕРМЕНТЫ И МЕТОДЫ В ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ Генетическая инженерия представляет собой отрасль молекулярной биологии, целью которой является получение организмов с новыми комбинациями генов с помощью направленного манипулирования фрагментами НК. Посредством экспериментальных процедур, используемых в генетической инженерии, возможен перенос генетического материала из одного организма в другой. Конечным результатом деятельности генетических инженеров является получение генетически модифицированных организмов (ГМО). В настоящие время под ГМО понимают организм, генотип которого был искусственно изменён при помощи приемов генетической инженерии. Последовательность приемов генетической инженерии, используемая при создании ГМО в общем виде следующая: получение изолированного гена (или другого генетического материала); введение гена (или другого генетического материала) в вектор, обеспечивающий его доставку в клетки трансформируемого организма. Результатом этого этапа является получение рекомбинантного (химерного) вектора, содержащего чужеродную ДНК; введение рекомбинантного вектора в клетки модифицируемого организма; получение ГМО. На рис. 4.1 представлена схема получения генетически модифицированных бактерий. Для достижения поставленных целей в генетической инженерии используются разнообразные ферменты и методы. Информация о них представлена ниже. 46

47 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Рис Получение генетически модифицированных бактерий Ферменты в генетической инженерии В экспериментах по генетической инженерии ферменты являются инструментами молекулярного манипулирования. Ферменты, применяемые в генетической инженерии, можно разделить на четыре основные группы: ферменты, фрагментирующие НК; ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК или РНК; ферменты, лигирующие фрагменты ДНК; ферменты, модифицирующие концы НК. Следует отметить, что все эти ферменты не обладают видовой специфичностью, и поэтому могут быть использованы в экспериментах по генетической инженерии как прокариот, так эукариот. 47

48 Прикладная молекулярная биология Ферменты, фрагментирующие ДНК Нуклеазы Нуклеазы катализируют гидролитическое расщепление фосфодиэфирных связей в молекулах нуклеиновых кислот (ДНК и РНК). Они могут разрезать НК с образованием 3 - гидроксильной или 5 - гидроксильной группы. 48

49 Глава 1. Определение нуклеотидной последовательности ДНК Нуклеазы в зависимости от типа НК, которую они расщепляют, могут быть разделены на две группы: НУКЛЕАЗЫ ДНКазы РНКазы ДНКазы катализируют расщепление ДНК, а РНКазы РНК. Нуклеазы могут быть специфичными к одноцепочечным или двухцепочечным НК (ДНК или РНК). Существуют нуклеазы, способные гидролизовать как ДНК, так и РНК. По месту расщепления НК нуклеазы могут быть разделены на две группы эндонуклеазы и экзонуклеазы: НУКЛЕАЗЫ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ ЭКЗОНУКЛЕАЗЫ Эндонуклеазы гидролизуют фосфодиэфирные связи внутри молекулы НК. Они могут расщеплять также кольцевые молекулы. В результате действия эндонуклеаз образуются полинуклеотидные фрагменты различной длины. Экзонуклеазы в отличии от эндонуклеаз расщепляют НК с концов цепей. Различают 5 3 -экзонуклеазы и 3 5 -экзонуклеазы экзонуклеазы расщепляют полинуклеотидную цепь, начиная с 5 -конца, а экзонуклеазы в обратном направлении. При этом одни экзонуклеазы отщепляют по одному нуклеотиду, другие олигонуклеотиды. Существуют экзонуклеазы, действующие в двух направлениях. Известна ДНКаза, которая является эндонуклеазой по отношению одноцепочечной ДНК и экзонуклеазой по отношению двухцепочечной ДНК. Существуют ферменты, способные расщеплять РНК в составе гибрида ДНК-РНК. Такие ферменты получили название РНКазы Н. Среди них различают эндонуклеазы и 3 5 -экзонуклеазы. Активностью РНКазы Н обладает обратная транскриптаза. 49

50 Прикладная молекулярная биология Среди эндонуклеаз выделяют особую группу ферментов рестриктазы (эндонуклеазы рестрикции). Они входят в состав системы рестрикции-модификации, которая присуща бактериям. Основная задача системы разрушение чужеродного генетического материала, проникшего в клетку (фагов и плазмид). В ее состав входят ферменты метилаза и рестриктаза. Система способна распознавать определённые полинуклеотидные последовательности, называемые сайтами рестрикции. Если ДНК не метилирована, то рестриктаза вносит в ДНК двуцепочечный разрыв, что приводит к нарушению ее биологической функции. Если же метилированы одна или обе цепи ДНК, рестриктаза не способна ее разрезать. Поскольку ДНК в бактериальной клетке либо полностью метилирована, либо метилирована только одна из ее цепей (сразу после репликации), рестрикции она не подвергается. Образовавшаяся после репликации полуметилированная ДНК метилируется при участии метилтрансферазы, в результате обе цепи ДНК оказываются метилированными. Чужеродная же ДНК, проникшая в клетку, не метилирована, и поэтому подвергается рестрикции. Так система рестрикции-модификации обезвреживает чужеродную ДНК, не разрушая собственную. Различают несколько типов рестриктаз: рестриктазы первого типа узнают определённую последовательность нуклеотидов и разрезают двухцепочную молекулу ДНК неподалёку от нее в произвольной точке; рестриктазы второго типа узнают определённую последовательность и разрезают ДНК в фиксированной точке внутри этой последовательности. Рестриктазы этого класса распознают в большинстве случаев палиндромные последовательности, состоящие обычно из 4-8 нуклеотидов; рестриктазы третьего типа узнают асимметричные последовательности и разрезают ДНК, отступив определённое число нуклеотидных пар от её конца (или в нескольких точках на разном удалении от сайта узнавания). В экспериментах по молекулярной биологии и генетической инженерии обычно используются рестриктазы второго класса. 50

51 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Названия рестриктаз (эндонуклеаз рестрикции) образуются от названия их продуцента. Первая буква названия рестриктазы совпадает с первой буквой названия рода, а следующие две с первыми двумя буквами вида организма, в котором фермент был обнаружен. Дополнительные буквы (могут отсутствовать в названиях) обозначают конкретный штамм или серотип. Римские цифры в конце названия указывают порядковый номер обнаружения фермента у конкретного организма. Например: BsuI первый фермент, обнаруженный у Bacillus subtilis, EcoRV пятый фермент, выделенный из Escherichia coli штамма RY13. Рестриктазы, расщепляя ДНК, вносят разрывы в обе цепи. В результате разрезания ДНК могут образовываться липкие и тупые концы (рис. 4.2). Липкие концы имеют выступающие одноцепочечные участки. Могут образовываться липкие концы с 5 -выступающими или 3 -выступающими нуклеотидными последовательностями. Тупые концы образуются тогда, когда рестриктаза вносит разрывы в цепи ДНК строго друг напротив друга. Тупые концы не имеют выступающих нуклеотидных последовательностей. В таблице 1 представлены данные о некоторых рестриктазах, об их сайтах узнавания и о характере расщепления ДНК. Рис Рестриктазы расщепляют ДНК с образованием липких концов (с 5 -выступающими (А) или 3 -выступающими (Б) нуклеотидными последовательностями) и тупых концов 51

52 Прикладная молекулярная биология Таблица 4.1 Характеристика некоторых рестриктаз Рестриктаза Сайт узнавания Организация образующихся в результате рестрикции концов EcoRI PstI Липкие концы с 5 -выступающими нуклеотидными последовательностями Липкие концы с 3 -выступающими нуклеотидными последовательностями PvuII Тупые концы Рестриктазы используются для фрагментации ДНК. С их помощью возможно расщепление протяженных молекул ДНК на фрагменты длиной от нескольких сотен до нескольких тысяч оснований. Полученные после рестрикции фрагменты ДНК можно разделить с помощью электрофореза в агарозном геле. Скорость перемещения фрагментов при электрофорезе обратно пропорциональна их размерам. Чем меньше размер фрагмента, тем больше его скорость перемещения, тем большее расстояние он пройдет. Сравнивая расстояние, пройденное фрагментом в процессе электрофореза, с расстояниями, пройденными фрагментами ДНК с известными размерами, можно определить размер каждого из фрагментов ДНК, образовавшегося в результате рестрикции. После разделения фрагменты можно элюировать из геля и затем использовать в дальнейших исследованиях. В результате расщепления образца ДНК определенной рестриктазой всегда образуется один и тот же набор фрагментов. Различные рестриктазы, имеющие неодинаковые сайты узнавания, расщепляя один и тот же образец ДНК, будут образовывать наборы фрагментов, отличающиеся по размеру. Сравнение размеров фрагментов ДНК, полученных после обработки определенного образца ДНК несколькими рестриктазами (по отдельности и со- 52

53 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии вместно), позволяет построить рестрикционную карту, на которой указано расположение каждого сайта рестрикции на исследуемой молекуле ДНК. Рестриктазы используют для построения рестрикционных карт. Рассмотрим, как это делается. Предположим, что ДНК, размер молекул которой составляет 3300 п.н., обработали по отдельности рестриктазой 1 и рестриктазой 2 (рис. 4.3). В результате расщепления рестриктазой 1 получили три фрагмента длиной 1 700, и 600 п.н., а при расщеплении рестриктазой 2 получили также три фрагмента, но их длина соответственно составила 1 900, и 200 п.н. При расщеплении этого же образца ДНК смесью рестриктаз 1 и 2 получили пять фрагментов, размеры которых соответственно равны 1 200, 800, 600, 500 и 200 п.н. На основании установленных размеров фрагментов ДНК необходимо далее определить их очередность расположения в исследуемой молекуле ДНК и определить расположение сайтов рестрикции для рестриктазы 1 и рестриктазы 2. Образование трех фрагментов при действии каждой из рестриктаз свидетельствует о том, что в исследуемой ДНК имеется по два сайта узнавания для каждой из рестриктаз. Образующийся в результате действия рестриктазы 1 фрагмент размером 600 п.н. не расщепляется при гидролизе смесью обеих рестриктаз (рис. 4.3), следовательно, он не будет содержать сайт рестрикции для рестриктазы 2. Фрагменты размером и п.н. расщепляются смесью рестриктаз, следовательно, каждый из них имеет по сайту узнавания для рестриктазы 2. При этом фрагмент размером п.н. распадается на куски по 500 и п.н., а фрагмент 1000 п.н. на куски по 200 и 800 п.н. (рис. 4.3). Образующийся в результате действия рестриктазы 2 фрагмент размером п.н. при гидролизе смесью рестриктаз распадается (рис. 4.3) на три фрагмента ( = 1 900), следовательно, он будет иметь два сайта узнавания для рестриктазы 1. Соответствие между положением сайтов рестрикции и размером фрагментов, образующихся в результате действия рестриктаз (по отдельности и совместно), представлено на рестрикционной карте (рис. 4.3). 53

54 Прикладная молекулярная биология Рис Построение рестрикционной карты. Р1 рестриктаза 1, Р2 рестриктаза 2 На практике при построении рестрикционных карт могут быть применены и другие подходы. Например, может быть использовано более двух рестриктаз, в этом случае этот процесс становится довольно непростой процедурой. Также может быть осуществлено неполное расщепление ДНК 54

55 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии рестриктазами, что в определенной степени может упростить решение поставленной задачи. Еще один прием, который используется при составлении карт рестрикции введение радиоактивной концевой метки. В этом случае определяют размеры полученных в результате рестрикции меченых фрагментов. Кроме того, перекрывающиеся фрагменты могут быть установены благодаря способности комплементарных последовательностей ДНК гибридизоваться. Рестрикционные карты нашли широкое применение в молекулярной биологии и генетической инженерии. Сравнение карт рестрикции родственных генов позволяет оценить степень гомологии между ними. Идентичность рестрикционных карт свидетельствует о высокой степени гомологии или может быть об идентичности исследуемых генов. Напротив, различие рестрикционных карт родственных генов позволяет предположить наличие значительных отличий в их нуклеотидных последовательностях. Поскольку рестрикционная карта отражает расположение определенных нуклеотидных последовательностей в образце ДНК, она может быть использована для определения первичной структуры данной ДНК. С этой целью вначале исследуемая ДНК разрезается с помощью рестриктаз. Затем полученные ее фрагменты разделяются с помощью электрофореза. Далее определяется первичная структура каждого фрагмента. На заключительном этапе, используя рестрикционную карту, расшифрованные нуклеотидные последовательности фрагментов располагают в очередности в соответствии с картой рестрикции. И так первичная структура ДНК определена. Ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК или РНК ДНК-полимераза Широко в генной инженерии используется ДНКполимераза I E. coli (Pol I). Этот фермент обладает 55

56 Прикладная молекулярная биология тремя активностями: полимеразной и и 3 5 -экзонуклеазными активностями. Благодаря полимеразной активности ДНК-полимераза I способна заполнять бреши в ДНК и превращать липкие концы в тупые (рис. 4.4). Рис ДНК-полимераза I способна заполнять бреши в ДНК (А) и превращать липкие концы в тупые (Б) В результате совместного действия полимеразной и экзонуклеазной активностей ДНК-полимеразы I в присутствии a- 32 Р-меченых днтф одноцепочечный разрыв в одной из цепей ДНК способен перемещаться вдоль ДНК, при этом синтезируется радиоактивно меченая ДНК (рис. 4.5). Этот процесс называется ник-трансляция. Рис В результате совместного действия полимеразной и экзонуклеазной активностей ДНК-полимеразы I в присутствии a- 32 Р-меченых днтф одноцепочечный разрыв в одной из цепей ДНК способен перемещаться вдоль ДНК, при этом синтезируется радиоактивно меченая ДНК 56

57 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии ДНК-полимераза 1 состоит из одной полипептидной цепи, которая образует три домена. N-концевой домен легко отделяется с помощью протеолитических ферментов. Оставшаяся часть получила название (по фамилии одного из авторов, описавших ее) фрагмент Кленова (Pol IK). Последний обладает полимеразной и 3 5 -экзонуклеазной активностями. Фрагмент Кленова обычно используют для достройки одноцепочечных 5 -концов до тупых, для синтеза второй цепи на одноцепочечной ДНК и для гидролиза одноцепочечных 3 -концов на двухцепочечных молекулах ДНК. При проведении ПЦР используются термостабильные ДНК-полимеразы: Tag ДНК-полимераза и Vent ДНК-полимераза. Обратная транскриптаза Обратная транскриптаза (ревертаза) обладает ДНКполимеразной активностью, использующей в качестве матрицы как РНК, так и ДНК, и активностью РНКазы Н, гидролизующей РНК в составе гибрида РНК ДНК. Для инициации синтеза ревертазе необходима затравка (праймер). Роль праймера может выполнять как РНК, так и ДНК. Ревертазу главным образом используют для обратной транскрипции ирнк (рис. 4.6) в комплементарную ДНК (кднк). В качестве затравки при обратной транскрипции ирнк, содержащих на 3 -конце полиа-последовательность, используют поли-дt-последовательность. После синтеза цепи ДНК комплементарной ирнк образуется гибрид ДНК- РНК. РНК в составе гибрида разрушают. Обычно для этой цели применяют щелочь. Далее осуществляют синтез второй цепи ДНК. В качестве матрицы при ее синтезе выступает первая цепь кднк. В этом случае используют способность ревертазы образовывать на 3 -концах одноцепочечных кднк шпильку, которая выполняет функцию праймера. Синтез второй цепи может катализировать как обратная транскриптаза, так и ДНК-полимераза I E.coli. По окончании синтеза цепи кднк остаются ковалентно связанными. Петлю, связывающую цепи, разрезают с помощью эндонуклеазы 57

58 Прикладная молекулярная биология S1, специфически гидролизующей одноцепочечные последовательности. Концы ДНК, образующиеся при расщеплении, могут оказаться выступающими. Превратить их в тупые можно с помощью фрагмента Кленова ДНКполимеразы I E.coli. Полученную кднк можно использовать для дальнейших исследований. Рис Синтез кднк с использованием ревертазы Ферменты, лигирующие фрагменты ДНК ДНК-лигаза ДНК-лигазы катализируют образование фосфодиэфирных связей между 5 -фосфатной и 3 -гидроксильной группами соседних дезоксинуклеотидов. В генетической инженерии и молекулярной биологии часто используются ДНК-лигаза фага Т4. Этот фермент способен катализировать 58

59 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии лигирование одноцепочечных разрывов, липких концов и двухцепочечных фрагментов ДНК с тупыми концами (рис. 4.7). Рис ДНК-лигаза фага Т4 катализирует лигирование одноцепочечных разрывов (А), липких концов (Б) двухцепочечных фрагментов ДНК с тупыми концами (В) Ферменты, модифицирующие концы НК Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза не нуждается в матрице, но требует затравку для своей работы. Этот фермент катализирует присоединение дезоксинуклеотидов к 3 -концу ДНК. При использовании в качестве субстрата одного типа дезоксинуклеотидов образуются молекулы ДНК, имеющие гомополимерные 3 -концы. Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза может быть использована для конструирования липких концов в молекулах ДНК с целью их объединения (рис. 4.8). С этой целью образец ДНК инкубируют с ферментом в присутствии одного дезоксинуклеотида (например, дттф). В результате в молекуле ДНК на 3 -концах образуются поли-дт-последовательности. Другой образец ДНК инкубируют с ферментом в присутствии комплементарного дезоксинуклеотида (датф). В этом случае на 3 -концах образуются комплементарные поли-да-последовательности. Смешивание таких молекул ДНК при определенных условиях приведет к образованию за счет липких концов гибридных молекул ДНК (рис. 4.8). 59

60 Прикладная молекулярная биология При гибридизации липких концов возможно образование брешей. Для их ликвидации применяют ДНК-полимеразы (рис. 4.8). Оставшиеся разрывы в цепях ДНК сшивают при помощи ДНК-лигазы (рис. 4.8). Рис Объединение молекул ДНК с помощью терминальной нуклеотидилтрансферазы Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза может использоваться для введения в 3 -концы ДНК радиоактивной метки в составе меченых дезоксинуклеотидов. ПолиА-полимераза ПолиА-полимераза использует в качестве субстрата АТФ (но не другие НТФ и датф), катализирует присоединение к 3 - концу одноцепочечных молекул РНК полиа-последовательностей (рис. 4.9). Применяется для присоединения полиа-последовательности к РНК при подготовке их молекул к копированию с помощью ревертазы 60

61 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии с целью получение кднк. ПолиА-полимераза применяется также для введения в 3 -конец РНК радиоактивной метки. Рис ПолиА-полимераза катализирует присоединение к 3 -концу РНК полиа-последовательности Фосфатазы Фосфатазы (фосфомоноэстеразы) катализируют гидролитическое расщепление 5 - фосфомоноэфиров или 3 - фосфомоноэфиров. Фосфатаза используется для удаления 5 -концевого фосфата с целью предотвращения лигирования двух соседних дезоксинуклеотидов с помощью ДНК-лигазы. 61

62 Прикладная молекулярная биология Последняя, как указано выше, может катализировать образование фосфодиэфирных связей меж-ду 5 -фосфатной и 3 -гидроксильной группами, но не между 5 - и 3 -гидроксильными группами. Полинуклеотидкиназа Полинуклеотидкиназа катализирует фосфорилирование 5 -концевых (но не 3 -концевых) гидроксильных групп ДНК и РНК. Этот фермент используется для мечения 5 - конца полинуклеотидной цепи с помощью радиоактивного Р-32 в составе АТФ: Полинуклеотидкиназа Введение меченого фосфата осуществляют после удаления немеченого 5 -фосфата с помощью фосфатазы. Методы в генетической инженерии Получение генов Гены для генно-инженерных экспериментов могут быть получены в результате их синтеза или выделены из природных источников. Синтез гена может быть осуществлен химическим способом или с помощью ПЦР. Эти подходы рассмотрены в главе «Синтез ДНК». Химический синтез гена возможен при условии, что известна его первичная структура или первичная структура полипептида, закодированного в нем. Для осуществления синтеза гена с использованием ПЦР требуется в качестве матрицы наличие самого гена и праймеров, комплементарных к его флангам. Кроме того, возможен синтез гена с помощью обратной транскриптазы на матрице ирнк, выделенной из клеток. Синтезированная таким образом ДНК будет отличаться от реального гена отсутствием регуляторных последовательностей и интронов. 62

63 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Ген может быть выделен из библиотеки генома. Прежде чем выделить ген из библиотеки генома, необходимо ее создать. Далее рассмотрим, каким образом создается библиотека генома (рис. 4.10). Вначале очищенную ДНК, выделенную из какого-либо организма, фрагментируют обычно с помощью рестриктаз. Далее фрагменты ДНК встраивают в вектор, например, плазмиду. Полученные химерные векторы вводят в бактериальные клетки. Затем клетки высевают на питательную среду и получают колонии, каждая из которых представляет собой клон, клетки которого являются потомками одной клетки. Все клетки одного клона имеют рекомбинантные плазмиды с идентичными фрагментами встроенной чужеродной ДНК. Совокупность клонированных фрагментов и называют библиотекой генома. При создании библиотеки генома с вероятностью 99 % попадания в нее всей ДНК необходимо получить число клонов для E.coli 1 500, дрожжей 4 600, дрозофил , млекопитающих Такие библиотеки созданы. При создании библиотеки генома могут быть использованы и вирусные векторы. Рис Схема получения библиотеки генома 63

64 Прикладная молекулярная биология Из библиотеки генома можно выделить искомый ген. В этом случае поступают следующим образом (рис. 4.11). На чашки Петри с клонами бактерий, содержащие определенные фрагменты чужеродной ДНК, накладывается нитроцеллюлозный фильтр. В результате на фильтре получается слепок колоний. Затем осуществляют лизис клеток, денатурацию и фиксацию ДНК на фильтре. Далее проводят гибридизацию с зондом, комплементарным искомому гену. После анализа результатов гибридизации выявляют колонии, содержащие рекомбинантную плазмиду с искомым геном. Клетки этой колонии отбирают и культивируют в питательной среде с целью увеличения их биомассы. Затем из бактериальных клеток выделяют рекомбинантную плазмиду, и из нее вырезают искомый ген с помощью той рестриктазы, которую использовали для получения библиотеки генома. Недостатком использования библиотек генома для выделения генов является то, что в результате дробления ДНК образуется огромное число фрагментов, и для их клонирования необходимо использовать большое количество клонов. Последнее обстоятельство затрудняет поиск нужного фрагмента ДНК в библиотеке. Кроме того, фрагменты ДНК обычно не полностью соответствуют искомому гену. Фрагмент может содержать нуклеотидные последовательности, не входящие в состав гена. А также, поскольку разрезание ДНК носит случайный характер, фрагменты могут содержать только часть гена. Рис Выделение гена из библиотеки генома. 1 перенос колоний на фильтр, 2 лизис клеток, денатурация ДНК и ее фиксация на фильтре, 3 гибридизация ДНК с зондом и выявление результата гибридизации, 4 культивирование клеток, содержащих рекомбинантную плазмиду с искомым геном, 5 выделение рекомбинантной плазмиды из культуры клеток, 6 вырезание с помощью рестриктазы из рекомбинантной плазмиды ДНК, содержащей искомый ген 64

65 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Кроме библиотеки генома может быть создана библиотека кднк (рис. 4.12). При создании такой библиотеки необходимо из клеток живого организма выделить содержащиеся в них ирнк. Потом при использовании их в качестве матрицы с помощью ревертазы осуществляют синтез кднк. Затем кднк встраивают в плазмиды и рекомбинантные плазмиды вводят в бактериальные клетки. Далее, размножая клетки, получают клоны бактерий, содержащих рекомбинантные плазмиды со строго определенной кднк. Поиск и выделение кднк из библиотеки кднк осуществляют аналогичным образом, как и в случае с библиотекой генома. Преимущество библиотеки кднк перед библиотекой генома заключается в том, что нуклеотидные последовательности кднк полностью соответствуют кодирующим последовательностям гена. кднк в отличие от реального гена не содержит интроны, поэтому ее можно использовать в генетической инженерии прокариот. Последние не способны осуществлять сплайсинг эукариотических РНК. Рис Схема получения библиотеки кднк 65

66 Прикладная молекулярная биология Определенный ген можно выделить из геномной ДНК. С этой целью вначале из клеток организма выделяют ДНК. Затем ее подвергают рестрикционному расщеплению. Полученные фрагменты подвергают электрофоретическому разделению в агарозном геле. После электрофореза на гель накладывают мембрану. В результате на ней образуется слепок, на котором фрагменты ДНК занимают те же положения, что и на электрофореграмме. Затем мембрану обрабатывают радиоактивно меченым зондом, комплементарным искомому гену. После гибридизации зонда на мембрану накладывают рентгеновскую пленку. После экспозиции на пленке проявляются засвеченные места, соответствующие расположению фрагмента ДНК, комплементарному зонду. Данный метод получил название Саузерн-блоттинг в честь ученого, разработавшего его Э.Саузерна. По расположению полосы гибридизации на фильтре устанавливают нахождение на электрофореграмме фрагмента ДНК, содержащего искомый ген. Извлекают его из геля и затем используют в дальнейших экспериментах. Введение гена в вектор и получение рекомбинантного вектора Под вектором понимают небольшую молекулу ДНК, способную автономно реплицироваться и обеспечивать размножение и функционирование встроенных в них генов. Вектор должен обладать следующими характеристиками: иметь точку начала репликации (ori) и автономно реплицироваться; содержаться в многочисленных копиях в клеткехозяине; сохраняться в дочерних клетках при делении материнской; обладать достаточной емкостью, позволяющей встраивать в них гены; содержать сайты рестрикции, используемые для встраивания гена в вектор; иметь маркеры, позволяющие осуществлять отбор клеток, содержащих рекомбинантный вектор. 66

67 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Для доставки чужеродных генов в клетки используют векторы, созданные на основе плазмид, вирусов и др. С этой целью в структуру вектора интегрируют чужеродную ДНК. Вектор, содержащий чужеродный ген, называется рембинантный или химерный вектор. Существует несколько способов введения генов в вектор. Рассмотрим их. Рекомбинантный вектор можно получить с использованием рестриктаз (рис. 4.13). В этом случае вектор и чужеродную ДНК, из которой получают ДНК-вставку, встраиваемую в вектор, разрезают с помощью одной и той же рестриктазы. В результате этого образовавшиеся липкие концы вектора и ДНК-вставки оказываются комплементарными. При их смешивании в присутствии ДНКлигазы происходит объединение вектора и ДНК-вставки с образованием рекомбинантного вектора. Рис Получение рекомбинантного вектора на основе плазмиды с использованием рестриктазы Помимо образования рекомбинантного вектора возможно внутримолекулярное лигирование вектора и ДНКвставки. В результате этого может произойти восстановление структуры исходного вектора или замыкание в кольцо ДНКвставки. Для увеличения выхода рекомбинантного вектора 67

68 Прикладная молекулярная биология его после рестрикции обрабатывают фосфатазой с целью удаления 5 -фосфомоноэфирных групп. При отсутствии последних ДНК-лигаза не может осуществлять лигирование, поскольку для образования фосфодиэфирных связей необходимо наличие 5 -фосфатной и 3 -гидроксильной групп соседних нуклеотидов. Таким образом, после обработки фосфатазой становится невозможным восстановление исходной структуры вектора, что приводит к увеличению выхода рекомбинантного вектора. Рекомбинантные векторы могут быть получены после их разрезания с образованием тупых концов и последующим лигированием с помощью ДНК-лигазы фага Т4 с чужеродной ДНК по тупым концам (рис. 4.14). Рис Получение рекомбинантного вектора на основе плазмид с использованием ДНК-лигазы фага Т4, сшивающей ДНК по тупым концам Для создания рекомбинантного вектора может быть использована терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза. С ее участием можно нарастить липкие концы, с помощью которых можно объединить молекулы ДНК. Особенности этого подхода описаны выше в теме «Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза» и представлены на рис. 4.8 и

69 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Рис Получение рекомбинантного вектора с использованием терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы Плазмидные векторы Плазмиды представляют собой автономно реплицирующиеся внехромосомные обычно кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК. Природные плазмиды могут быть использованы в качестве вектора для переноса чужеродной ДНК. Однако они не всегда высокоэффективны. В связи с этим для достижения высокой эффективности функционирования плазмидные векторы создаются с помощью методов генетической инженерии. Плазмидные векторы должны: 69

70 Прикладная молекулярная биология иметь небольшой размер, с увеличением размера вектора снижается размер встраиваемой в него чужеродной ДНК; иметь в своем составе сайт рестрикции, по которому может быть осуществлено встраивание чужеродной ДНК; иметь в своем составе селективные маркеры, необходимые для идентификации клеток, захвативших рекомбинантную ДНК. В настоящее время сконструировано множество плазмидных векторов, используемых в генетической инженерии. Широкое применение нашел плазмидный вектор pbr322 (p от англ. plasmid, BR инициалы создателей Ф.Боливара и Р.Радригиса, 322 число, взятое из исследовательских протоколов). Его размер составляет 4361 п.н. Эта плазмида (рис. 4.16) несет ori, обеспечивающий репликацию плазмиды только в клетках E.coli, два селективных маркера гены устойчивости к антибиотикам ампициллину и тетрациклину, по одному сайту рестрикции для нескольких рестриктаз (среди них в гене устойчивости к тетрациклину для Hind III, BamH I и Sal I, а в гене устойчивости к ампициллину для Pvu I и Pst I). Плазмида в клетках может реплицироваться с образованием большого числа копий, что обеспечивает присутствие в бактериальной клетке чужеродной ДНК в составе рекомбинантной pbr322 также в большом числе копий. Рис Плазмида pbr322. ГУТ ген устойчивости к тетрациклину, ГУА ген устойчивости к ампициллину. Указаны сайты узнавания для рестриктаз 70

71 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Клетки E.coli, содержащие pbr322, способны расти в среде, содержащей как ампициллин, так и тетрациклин, или оба эти антибиотика. Напротив, бактериальные клетки, в которых данная плазмида отсутствует, не растут в среде, содержащей любой из этих антибиотиков или оба антибиотика. В то же время бактериальные клетки, содержащие плазмиду, в области гена устойчивости к тетрациклину которой осуществлена вставка чужеродной ДНК, будут устойчивы к ампициллину, но не будут расти в присутствии тетрациклина (рис. 4.17). Если же ввести чужеродную ДНК в состав гена устойчивости к ампициллину, то наблюдается обратная картина (рис. 4.17). Таким образом, чувствительность клеток E.coli к указанным антибиотикам позволяет идентифицировать в них наличие или отсутствие рекомбинантной или интактной pbr322. Рис Вставка чужеродной ДНК в область генов устойчивости к антибиотикам плазмиды pbr322 влияет на чувствительность бактериальных клеток к соответствующим антибиотикам. ГУТ ген устойчивости к тетрациклину, ГУА ген устойчивости к ампициллину 71

72 Прикладная молекулярная биология Находят свое применение плазмидные векторы, содержащие в своем составе в качестве селективного маркера ген lac-z, кодирующего фермент β-галактозидазу. Этот фермент катализирует расщепление субстрата X-gal с образованием окрашенного в голубой цвет продукта. В качестве примера рассмотрим организацию вектора puc 18 (рис. 4.18). Эта плазмида имеет размер п.н. и содержит в своем составе помимо гена lac-z, ген устойчивости к ампициллину. В гене lac-z расположен участок, называемый полилинкер, в котором находятся сайты узнавания для рестриктаз. Именно в него осуществляют вставку чужеродной ДНК. В результате такой вставки нарушается организация гена lac-z и он теряет способность экспрессироваться с образованием функционально активной β-галактозидазы. Рис Плазмида puc 18. ГУА ген устойчивости к ампициллину Бактериальные клетки, содержащие как рекомбинантный со вставкой чужеродной ДНК, так и нерекомбинантный векторы puc 18, в отличие от бесплазмидных клеток способны расти в среде с ампициллином. При этом колонии клеток с нерекомбинантном вектором окрашены в голубой цвет, а колонии с рекомбинантной плазмидой будут белыми (рис. 4.19). Так селективные маркеры позволяют идентифицировать наличие вектора в бактериальных клетках. 72

73 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Рис Вставка чужеродной ДНК в область гена lac-z плазмиды puc 18 нарушает его экспрессию. ГУА ген устойчивости к ампициллину Фаговые векторы Фаговые векторы предпочтительнее использовать, чем плазмидные векторы, при клонировании более крупных фрагментов чужеродной ДНК. Наиболее распространенными фаговыми векторами для E.coli являются векторы, созданные на основе фагов λ и М13. Для фага λ характерно два альтернативных пути развития: литический и лизогенный. В случае литического пути развития после проникновения фага в клетку его гены начинают экспрессироваться в определенной последовательности. Результатом их экспрессии является образование порядка 100 фаговых частиц на клетку. Затем происходит лизис клетки и фаговые частицы оказываются в окружающей среде. При лизогенном пути развития ДНК фага встраивается в ДНК бактерии и реплицируется вместе с ней. Спонтанно или под действием каких-либо факторов фаг λ может перейти на литический путь развития. Геном фага λ может быть представлен множественными формами (рис. 4.20). Внутри фаговой частицы геном фага λ находится в линейной форме. При попадании фага λ в клетку, его ДНК замыкается в кольцо за счет липких концов. Во время репликации ДНК фага λ образует длинные конкатемеры, которые затем разрезаются на индивидуальные геномные ДНК фага λ. И четвертая форма интегрированная форма ДНК фага λ в клеточном геноме. 73

74 Прикладная молекулярная биология Рис Геном фага λ может быть представлен линейной (1), кольцевой (2), конкатемерной (3) и интегрированной (4) в клеточный геном формами Геном фага λ полностью расшифрован и его размер составляет п.н. (рис. 4.21). ДНК фага содержит область начала репликации (ori), гены структурных белков, участвующих в формировании вирусной частицы, гены ферментов, принимающих участие в репликации, гены, обеспечивающие лизис инфицированных клеток, и гены, ответственные за установление лизогении. Около 1/3 части генома между точками т.п.н. являются необязательной для установления литической инфекции. В этом участке генома представлены гены, необходимые для установления лизогенного состояния. Несущественной является также область ДНК вблизи точки 43 т.п.н. При конструировании векторов на основе ДНК фага λ, все гены или часть генов, необходимых для лизогении, удаляются. Поэтому инфицирование всегда сопровождаются лизисом клеток. Для успешной упаковки ДНК фага λ в вирионе ее длина должна составлять т.п.н. В связи с этим все 74

75 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии удаленные последовательности ДНК при конструировании рекомбинантного вектора могут быть заменены сегментом чужеродной ДНК соответствующей длины. Рис Линейный геном фага λ. Необязательные для литической инфекции участки генома показаны широкими линиями На основе фага λ создано множество λ-векторов. Эти векторы подобно фагу могут размножаться посредством литической инфекции. Наличие сайтов рестрикции в их геноме позволяет осуществить удаление несущественной области и обеспечить встраивание чужеродной ДНК (рис. 4.22). Размер встраиваемого фрагмента может составлять до 24 т.п.н. Рис Схема встраивания чужеродной ДНК в l-вектор. СР сайт рестрикции 75

76 Прикладная молекулярная биология Некоторые λ-векторы содержат ген β-галактозидазы. При создании рекомбинантного λ-вектора вместе с несущественной областью удаляется и ген β-галактозидазы. При инфицировании бактериальных клеток, выращиваемых на среде с X-gal, нерекомбинантным λ-вектором, на их колониях будут формироваться голубые бляшки. При инфицировании же бактериальных клеток рекомбинантным λ-вектором будут формироваться бесцветные бляшки. Так можно различить рекомбинантный и нерекомбинантный λ-векторы. Широкое применение в генетической инженерии нашли векторы, сконструированные на основе фага М13. Геном фага представлен кольцевой одноцепочечной ДНК, размер которой составляет около нуклеотидов. После инфицирования клеток E.coli одноцепочечная ДНК превращается в двухцепочечную кольцевую форму. Затем происходит репликация таких молекул с образованием приблизительно 300 копий, которые впоследствии используются в качестве матриц для синтеза одноцепочечных фаговых ДНК. Одновременно с синтезом ДНК происходит экспрессия фаговых генов. Одноцепочечные фаговые ДНК совместно с белками капсида формируют зрелые фаговые частицы, которые покидают клетки, образуя на бактериальной колонии мутные бляшки. Бактериальные клетки при этом не погибают, хотя их рост замедляется. При создании рекомбинантной ДНК используют двухцепочные репликативные формы ДНК фага М13. Одноцепочечные же ДНК фага не применяются в качестве векторов, поскольку не могут быть разрезаны с помощью рестриктаз. В геноме фага М13 имеется некодирующая область, длина которой составляет 507 нуклеотидов. В этот сайт может быть встроена вставка, не приводящая к нарушению репликации ДНК фага. Часто в эту область при создании векторов встраивают фрагмент lac-оперона E.coli, содержащий часть гена β-галактозидазы, и так называемый полилинкер (рис. 4.23). Полилинкер содержит сайты узнавания для нескольких рестриктаз. Именно в полилинкер при создании 76

77 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии рекомбинантного вектора встраивают чужеродную ДНК. В отсутствии в составе полилинкера вставки чужеродной ДНК векторный геном детерминирует синтез β-галактозидазы. При наличии в среде субстрата Xgal, бляшки окрашиваются в голубой цвет. При наличии же вставки чужеродной ДНК в составе полилинкера синтез β-галактозидазы нарушается и формируются бесцветные бляшки (рис. 4.23). Таким образом, можно различить бляшки, содержащие рекомбинантный и нерекомбинантный векторы. Рис Схема получения рекомбинантного вектора на основе фага М13. 1 введение в некодирующую область генома фага фрагмента lac-оперона E.coli, содержащего часть гена β-галактозидазы, и так называемый полилинкер. 2 введение в область полилинкера чужеродной ДНК Космиды Космиды являются гибридными векторами, состоящими из плазмидной ДНК и фрагментов ДНК фага λ (рис. 4.24). Плазмидная составляющая содержит уникальные сайты рестрикции и селективные маркеры, а фаговая соединенные липкие концы (cos-сайт). Космиды реплицируются по плазмидному типу репликации и способны упаковываться в оболочки фага λ. В состав космидного вектора может быть включена вставка чужеродной ДНК до 45 т.п.н. 77

78 Прикладная молекулярная биология Рис Космида Клонирование чужеродной ДНК при использовании космид осуществляют следующим образом (рис. 4.25). Вначале космиду разрезают с помощью рестриктазы. Далее линейную космиду смешивают с чужеродной ДНК, липкие концы которой комплементарны липким концам космиды. После отжига и лигирования образуются конкатемеры. Обработка конкатемеров белками, осуществляющими упаковку ДНК фага λ, приводит к вырезанию из конкатемеров по cos-сайтам фагового генома, содержащего ДНК-вставку. Наличие cos-сайтов является единственным необходимым требованием для упаковки ДНК в фаговые частицы. Таким образом, последовательность нуклеотидов ДНК, расположенная между двумя cos-сайтами, может быть упакована в фаговые частицы. Фаговая частица, содержащая между cos-сайтами только чужеродную ДНК, будет нежизнеспособной. В то же время после адсорбции такой фаговой частицы на поверхности клетки, заключенная в ней ДНК поступает внутрь бактерии, где она начинает реплицироваться как плазмида. Поскольку плазмида (космида) содержит в своем составе селективные маркеры генов устойчивости к антибиотикам бактериальные клетки выращивают на среде с соответствующими антибиотиками. С одной стороны, наличие плазмиды обеспечивает выживание бактериальных клеток, а выращивание бактерий на среде с антибиотиками, с другой стороны, обеспечивает сохранение таких плазмид в клетках. 78

79 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Упаковка ДНК космид в фаговые частицы необходима только для облегчения процесса введения рекомбинантных ДНК большого размера внутрь бактериальных клеток. Проникшая внутрь клетки рекомбинантная космида может в ней существовать как плазмида и не может быть упакована в фаговую частицу. Рис Схема клонирования чужеродной ДНК при использовании космид 79

80 Прикладная молекулярная биология Фазмиды Фазмиды, также как и космиды, являются гибридами плазмид и фага, однако в отличие от космид, в них сохранены функции репликации как плазмиды, так и фага. Фазмиды представляют собой линейные молекулы ДНК, на концах которой находятся сегменты ДНК фага λ, содержащие гены, необходимые для литической инфекции, а в центральной части плазмидный сегмент, обычно состоящий из нескольких повторов последовательностей плазмидной ДНК. В процессе получения рекомбинантной фазмиды, один или несколько повторов плазмидной ДНК заменяется чужеродной ДНК. Попадая в клетку, фазмида в зависимости от ее конструкции и от условий выращивания бактерий может реплицироваться либо как фаговая ДНК, либо как плазмида. Таким образом, фазмиды в одних условиях могут размножаться как плазмиды, а в других как фаги. Размножение фазмиды как фага, заканчивается лизисом клеток и выходом фаговых частиц из клетки. Челночные векторы Особенностью челночных векторов является способность их реплицироваться в двух разных видах организмов. Такие векторы содержат две области начала репликации, соответствующие каждому из обоих видов хозяев. Существуют челночные векторы, способные существовать как в клетках двух видов прокариот, так и в клетках прокариот (обычно в E.coli) и эукариот (дрожжи, растения, животные). Векторы, используемые для введения чужеродной ДНК в клетки животных Для введения чужеродной ДНК в клетки животных часто используют векторы, сконструированные на основе вирусов. Широкое применение нашли векторы, созданные на основе SV40. Геном этого вируса представлен кольцевой двухцепочечной ДНК, размер которой составляет 5243 пн. В геноме имеется ori и закодировано 5 белков: малый Т антиген, большой Т антиген и три белка капсида VP1, VP2 и VP3. Большой Т антиген необходим для репликации ДНК 80

81 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии вируса. В инфицированной клетке образуется около вирусных частиц, которые покидая клетку, вызывают её гибель. При создании векторов на основе SV40 удаляют определенные нуклеотидные последовательности ДНК-вируса и вместо них в геном встраивают другие фрагменты ДНК. Существуют три типа векторов, созданных на основе SV40: трансдуцирующие SV40-векторы. Такие векторы способны реплицироваться в клетках-хозяинах и упаковываться в вирионы. При их создании осуществляют замену кодирующих последовательностей ДНК вируса на фрагмент чужеродной ДНК эквивалентного размера. В результате такой замены вектор теряет способность формировать вирусные частицы, из-за утраты способности обеспечивать синтез белка(ов), ген(ы) которого(ых) был(и) удалены из генома. Компенсировать утраченный синтез белка(ов) может вирус-помощник дикого типа. Последний, находясь в клетке совместно с трансдуцирующим вектором, способен обеспечить синтез всех белков, необходимых для удовлетворения как своих потребностей, так и потребностей трансдуцирующего SV-вектора. Таким образом, в присутствии вируса-помощника трансдуцирующий вектор будет упакован в вирион; плазмидные SV40-векторы. В их составе присутствует ori и ген большого Т антигена, в то же время гены белков капсида VP1, VP2 и VP3 отсутствуют. В связи с этим плазмидные векторы способны реплицироваться, но не упаковываться в вирионы. Плазмидные векторы могут быть челночными и содержать последовательности ДНК, позволяющие им реплицироваться как в клетках прокариот, так и клетках эукариот; пассивные трансформирующие векторы. Они не способны ни реплицироваться, ни упаковываться в вирионы. Такие векторы представляют собой молекулы ДНК, которые содержат сегменты генома SV40, ответственные за экспрессию генов. Пассивные векторы способны осуществить доставку чужеродной ДНК и внедрить ее в клеточную ДНК. 81

82 Прикладная молекулярная биология Широкое применение в генетической инженерии нашли векторы, созданные на основе ретровируса. Геномной НК ретровирусов является РНК. Их жизненный цикл следующий. После адсорбции вириона на поверхности клетки и проникновения в нее происходит копирование РНК в результате обратной транскрипции с образованием двухцепочечной ДНК, которая затем интегрирует в клеточный геном. Интегрированная ДНК транскрибируется с образованием геномных и субгеномных РНК. Оба типа РНК служат матрицами для синтеза белка. После накопления вирус-специфических белков происходит формирование вирусных частиц и высвобождение их из клетки (рис. 4.26). Рис Жизненный цикл ретровирусов При конструировании векторов на основе ретровирусов обычно часть ретровирусных генов удаляют. При этом определенные нуклеотидные последовательности, необходимые для обратной транскрипции, экспрессии генов, упаковки генома в вирионы должны быть сохранены. При получении рекомбинантного ретровирусного вектора чужеродные 82

83 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии нуклеотидные последовательности встраивают, замещая удаленные области генома. Далее рекомбинантный вектор с помощью различных ухищрений упаковывается в вирион, который способен обеспечить доставку генетического материала в клетку и его интеграцию в клеточный геном. Таким образом, векторы, созданные на основе ретровирусов, способны не только доставлять чужеродный генетический материал в клетку, но и интегрировать его в ДНК клетки хозяина. Интегрированная чужеродная ДНК будет реплицироваться вместе с клеточной ДНК, и передаваться при делении материнской клетки потомкам. Векторы, используемые для введения чужеродной ДНК в клетки растений В генетической инженерии растений для трансформации растительных клеток используют векторы, созданные на основе вирусов. Например, вируса мозаики цветной капусты и др. Преимущество вирусов, используемых в качестве векторов, заключаются в том, что они легко проникают в клетку и в ней размножаются. При этом число копий вирусного генома в клетке может достигать десятков тысяч. Следовательно, число копий чужеродного гена в клетке достигает такого же значения. Наличие большого числа копий генов может обеспечить сверхсинтез белкового продукта. К недостаткам вирусных векторов относится ограниченный размер вводимых в них чужеродной ДНК и то, что вирусы имеют ограниченный круг хозяев. В настоящее время считается, что для доставки генетического материала в растительные клетки наиболее перспективно применение векторов, сконструированных на основе Ti- плазмиды Agrobackteria tumefaciens. Эти почвенные бактерии способны вызывать образование опухолей (корончатых галлов) у растений. Клетки корончатых галлов так же, как и раковые клетки животных, способны к неограниченному росту. Опухолеродным агентом у Agrobackteria tumefaciens является ее Ti-плазмида. После того как бактерии попадают в пораженные ткани растений, 83

84 Прикладная молекулярная биология Ti-плазмида проникает в растительные клетки. Затем часть ДНК плазмиды, так называемая Т-ДНК, интегрирует в геном растения. В результате экспрессии интегрированной Т-ДНК образуются белки, которые обеспечивают трансформацию растительных клеток в клетки корончатых галлов. Ti-плазмида представляет собой кольцевую двухцепочечную молекулу ДНК, длина которой составляет т.п.н. В ее состав входят: T-ДНК (12 20 т.п.н.). T-ДНК встраивается в геном растений и кодирует ферменты биосинтеза фитогормонов и опинов (производных аминокислот). Продукты генов Т-ДНК вызывают образование корончатых галлов; vir-область, содержит гены, ответственные за перенос Т-ДНК в геном растений; tra-область, включает гены, контролирующие конъюгацию бактерий; ori-область, содержит последовательности ДНК, ответственные за репликацию Ti-плазмиды. Ti-плазмида содержит два набора генов: один из которых экспрессируется в клетках бактерий, другой в клетках растений. Регуляция экспрессии генов в составе Т-ДНК осуществляется посредством элементов, функционирующих в клетках растений, в то время как остальные гены находятся под контролем бактериальных промоторов. Необходимо обратить внимание, что для образования корончатых галлов необходимы гены обеих групп. Возможность использования Ti-плазмид в качестве вектора обусловлена тем, что круг хозяев агробактерий широк; они способны трансформировать практически все двудольные растения, кроме того можно добиться трансформации однодольных растений, в том числе злаков; интегрированная в геном Т-ДНК наследуется как доминантный признак. При создании рекомбинантных векторов на основе Ti-плазмиды чужеродную ДНК встраивают в состав Т-ДНК. Способность последней интегрировать в геном растений обеспечивает внедрение и чужеродной ДНК. 84

85 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Векторная система, созданная на основе Ti-плазмид, должна: содержать сигналы для переноса и интеграции Т-ДНК в ядерный геном растений; содержать промотор, обеспечивающий экспрессию чужеродных генов. Промотор должен обладать достаточной силой и узнаваться РНК-полимеразой растений. Может использоваться регулируемый промотор. Например, промотор генов белков теплового шока. Гены с таким промотором будут экспрессироваться при повышенной температуре. Другой регулируемый промотор промотор гена малой субъединицы рибулозобисфосфаткарбоксилазы (фермент, участвующий в фотосинтезе) активен только в фотосинтезирующих тканях. Часто в генетической инженерии используется промотор гена вируса мозаики цветной капусты. Гены с таким промотором активно экспрессируются во всех тканях; содержать маркер, необходимый для селекции трансформированных клеток. В качестве маркеров могут быть использованы гены lux A и lux B, выделенные из ДНК светлячков, и контролирующие синтез люциферазы. Этот белок обеспечивает переход люцефиринов из окисленной формы в восстановленную форму. Такой переход сопровождается свечением. Также в качестве маркера применяется ген pgfp, выделенный из медузы Acquorea victoria, контролирует синтез GFP-белка. Трансгенные растения с этим геном светятся зеленым светом в ультрафиолете; не содержать онкогенов, подавляющих дифференцировку растительных клеток. Рекомбинантные Ti-плазмиды используют для получения трансгенных растений. С этой целью растительные клетки обрабатывают бактериями, содержащими рекомбинантную плазмиду. Последняя обеспечивает доставку чужеродных генов в составе Т-ДНК в растительный геном. Затем из отдельных клеток выращивают трансгенные растения. Следует отметить, что в результате эксперимента не все растительные клетки подвергаются трансформации. Отбор трансгенных растений от нетрансформированных 85

86 Прикладная молекулярная биология можно осуществить с помощью маркеров. Если в качестве маркера использовался ген pgfp, то трансгенные растения в отличие от нетрансгенных растений будут светиться в ультрафиолете. Введение рекомбинантного вектора в клетки модифицируемого организма Гены как в прокариотические, так и экариотические клетки могут быть введены с использованием векторов, сконструированных на основе вирусов. Вирусы способны обеспечить проникновение рекомбинантного вектора внутрь клетки. При этом каждая клетка может получить большое число копий чужеродного гена. Более того, в некоторых случаях вирусы обеспечивают встраивание чужеродного гена в состав клеточного генома. Возможна доставка чужеродной ДНК в клетки и без участия вирусов. Этот процесс называется трансфекция. Существуют несколько методов доставки чужеродной ДНК в клетки на основе трансфекции: кальций-фосфатная трансфекция; микроинъекция; электропорация; биобаллистическая трансформация, липофекция и др. Кальций-фосфатная трансфекция является одним из самых простейших методов доставки чужеродной ДНК в клетки. В этом случае к раствору, содержащему ДНК и фосфат, добавляют хлорид кальция. В результате образуются частицы кальциевого преципитата, состоящего из фосфата кальция и ДНК. Преципитатом обрабатывают клетки, которые путем фагоцитоза поглощают частицы. В составе преципитата внутрь клеток проникает и ДНК. Эффективность трансформации клеток таким способом невелика. Ее можно несколько увеличить, используя какиелибо вещества, например, глицерин, или этиленгликоль. Метод микроиньекций широко используется при переносе генов в процессе получения трансгенных животных. Определенное количество копий генетического материала инъецируется при помощи микропипетки в клеточное ядро (рис. 4.27). Чужеродную ДНК обычно вводят в одноклеточный эмбрион зиготу. 86

87 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Рис Метод микроинъекций. С помощью микропипетки в ядро клетки вводится раствор ДНК Метод электропорации основан на способности клеточной мембраны становиться проницаемой для молекул ДНК под действием импульсов тока высокого напряжения. В результате воздействия тока, в мембранах клеток формируются поры, через которые способны проходить молекулы ДНК. При проведении эксперимента (рис. 4.28) в среду вносят клетки и чужеродную ДНК, которую необходимо ввести в эти клетки. Через среду пропускают высоковольтные импульсы электрического тока, приводящие к образованию пор в мембране. Через эти поры ДНК проникает в клетку. Электропорация успешно используется для введения молекул ДНК в клетки животных, простейших, растений, дрожжей, бактерий. Рис Электропорация 87

88 Прикладная молекулярная биология Принцип метода биобаллистической трансформации (рис. 4.29) основан на том, что на мельчайшие частички металла (вольфрама, платины или золота) наносится чужеродная ДНК. Металлические частички, покрытые ДНК, помещаются внутрь биобаллистической пушки. В пушке уменьшается давление до 0,1 атм. В этот момент частички металла с огромной скоростью выстреливаются из пушки и, пробивая мембраны, попадают в цитоплазму и ядра клеток. Так чужеродная ДНК проникает внутрь клеток. Рис Биобаллистическая трансформация Метод липофекции основан на использовании липосом для доставки ДНК в клетки. Липосомы представляют собой сферические структуры, оболочки которых образованы бислоем фосфолипидов (рис. 4.30). Их получают в результате обработки ультразвуком или резкого встряхивания водных эмульсий фосфолипидов. При осуществлении липофекции ДНК помещают в липосомы. Таким образом, генетический материал защищается от действия нуклеаз. Липосомы способны сливаться с клеточной мембраной, после чего их содержимое проникает в клетки. Так ДНК доставляется внутрь клеток. Рис Липосома 88

Глава 11 Методы анализа генов

Глава 11 Методы анализа генов Глава 11 Методы анализа генов 1. CS Ферменты рестрикции: a) используются в ПЦР; b) узнают одноцепочечную ДНК; c) узнают и разрезают специфические двуцепочечные последовательности ДНК; d) встречаются у

Подробнее

МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОВ

МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОВ 12 МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОВ Гены являются молекулярным субстратом наследственности. Структура и локализация генов в геноме определяет свойства организма. При функционировании генома и в результате взаимодействия

Подробнее

Занятие 7. СОВРЕМЕННЫЕ МОЛЕКУЛЯРНО- БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА ДНК. Цель занятия: ознакомиться с основными молекулярнобиологическими

Занятие 7. СОВРЕМЕННЫЕ МОЛЕКУЛЯРНО- БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА ДНК. Цель занятия: ознакомиться с основными молекулярнобиологическими Занятие 7. СОВРЕМЕННЫЕ МОЛЕКУЛЯРНО- БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА ДНК Цель занятия: ознакомиться с основными молекулярнобиологическими методами анализа ДНК. 1. Определение нуклеотидной последовательности

Подробнее

МОЛЕКУЛЯРНО- ГЕНЕТИЧЕСКИЙ МЕТОД

МОЛЕКУЛЯРНО- ГЕНЕТИЧЕСКИЙ МЕТОД P A R T N E R ' S P R E S E N T A T I O N МОЛЕКУЛЯРНО- ГЕНЕТИЧЕСКИЙ МЕТОД Вороная Ю.М 1мед 1группа S E C T I O N F O U R МОЛЕКУЛЯРНО - ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ Большая и разнообразная группа методов, предназначенная

Подробнее

ТЕХНОЛОГИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК

ТЕХНОЛОГИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК 11 ТЕХНОЛОГИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК Расшифровывая тайны структуры генов, ученые начали их выделять и синтезировать. 30 лет назад тех, которые верили в успех этих начинаний было мало, и никто даже не предполагал

Подробнее

ДНК-ЗОНДЫ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ВИРУСОЛОГИИ Галина Я.С., Николаева О.Н. ФГБОУ ВО Башкирский ГАУ Уфа, Россия

ДНК-ЗОНДЫ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ВИРУСОЛОГИИ Галина Я.С., Николаева О.Н. ФГБОУ ВО Башкирский ГАУ Уфа, Россия ДНК-ЗОНДЫ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ВИРУСОЛОГИИ Галина Я.С., Николаева О.Н. ФГБОУ ВО Башкирский ГАУ Уфа, Россия THE DNK-PROBES AND THEIR USE IN VIROLOGY Galina Y.S., Nikolaeva O.N. The Bashkir State Agrarian

Подробнее

Гибридизация нуклеиновых кислот

Гибридизация нуклеиновых кислот Гибридизация нуклеиновых кислот Гибридизация нуклеиновых кислот T m температура плавления Методы, основанные на гибридизации нуклеиновых кислот Хорошо охарактеризованная ДНК или олигонуклеотидные фрагменты

Подробнее

Готовые решения для лабораторной диагностики молекулярными методами. Каширина Мария Молекулярный биолог ЗАО «БиоХимМак»

Готовые решения для лабораторной диагностики молекулярными методами. Каширина Мария Молекулярный биолог ЗАО «БиоХимМак» Готовые решения для лабораторной диагностики молекулярными методами Каширина Мария Молекулярный биолог ЗАО «БиоХимМак» Исследование фрагментов нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) Основные этапы: В клетке

Подробнее

РАЗДЕЛ II ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ ОСНОВНЫЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

РАЗДЕЛ II ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ ОСНОВНЫЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ РАЗДЕЛ II ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ ОСНОВНЫЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ Генная инженерия это отрасль молекулярной биологии и генетики, целью которой является получение с помощью лабораторных приемов организмов с новыми,

Подробнее

Основные генетические механизмы

Основные генетические механизмы Основные генетические механизмы Тренинг «Использование методики Xpert MTB/RIF», г.душанбе, 29 июля 2 августа 2013 г. Презентация подготовлена в рамках проекта USAID «Посилення контролю за туберкульозом

Подробнее

Лекция 7. Нуклеиновые кислоты Структура ДНК Синтез ДНК Мутации Структура РНК

Лекция 7. Нуклеиновые кислоты Структура ДНК Синтез ДНК Мутации Структура РНК Лекция 7 Нуклеиновые кислоты Структура ДНК Синтез ДНК Мутации Структура РНК Нуклеиновые кислоты ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) ирнк (рибонуклеиновая кислота) линейные полимеры, мономерами которых

Подробнее

ДНК ДИАГРАММА 01: Что такое ДНК? Какую структуру имеет ДНК? Глава 1: Что такое ДНК? Рекомендуемые фильмы

ДНК ДИАГРАММА 01: Что такое ДНК? Какую структуру имеет ДНК? Глава 1: Что такое ДНК? Рекомендуемые фильмы ДНК БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ И ДНК ДНК Глава 1: Что такое ДНК? Что такое ДНК? ДНК это длинная макромолекула внутри клетки, несущая в себе генетическую информацию о синтезируемых белках. Генетический код образован

Подробнее

Генетическая инженерия

Генетическая инженерия *Генная Инженерия Генетическая инженерия Генетическая инженерия (генная инженерия) совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток),

Подробнее

Решение биологических задач на тему «Генетический код. Биосинтез белка»

Решение биологических задач на тему «Генетический код. Биосинтез белка» Решение биологических задач на тему «Генетический код. Биосинтез белка» Типы задач 1. Определение последовательности аминокислот в фрагменте молекулы белка на основании последовательности нуклеотидов ДНК

Подробнее

ПЦР в реальном времени

ПЦР в реальном времени ПЦР в реальном времени Одним из самых современных вариантов ПЦР является ПЦР в реальном времени(3). Название отражает общий смысл новой модификации. ПЦР в реальном времени основана на количественной детекции

Подробнее

Тема: «Нуклеиновые кислоты. ДНК»

Тема: «Нуклеиновые кислоты. ДНК» Глава I. Основы цитологии На дом: 12 Тема: «Нуклеиновые кислоты. ДНК» Задачи: Дать характеристику нуклеиновым кислотам: видам НК, локализации их в клетке, строению, функциям. Изменено, дополнено Нуклеиновые

Подробнее

Генетика ДИАГРАММА 01: Что такое ДНК? Каким образом ДНК кодирует белок? Глава 1: Гены и ДНК. Рекомендуемые фильмы

Генетика ДИАГРАММА 01: Что такое ДНК? Каким образом ДНК кодирует белок? Глава 1: Гены и ДНК. Рекомендуемые фильмы Генетика БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ И ДНК ГЕНЕТИКА Глава 1: Гены и ДНК Что такое ДНК? ДНК это длинная макромолекула внутри клетки, несущая в себе генетическую информацию о синтезируемых белках. Генетический код образован

Подробнее

Рекомендации по постановке ПЦР

Рекомендации по постановке ПЦР Рекомендации по постановке ПЦР К наборам реактивов ## PK101, PK121. К полимеразам ## PK002S/L, PK013, PK014, PK015, PK016, PK022, PK123S/L. К готовым смесям для ПЦР ## PK041S/L, PK143S/L, PK145S/L, PK147S/L,

Подробнее

Занятие 6. ВЕКТОРНЫЕ СИСТЕМЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ В КЛЕТКАХ ПРОКАРИОТ И ЭУКАРИОТ.

Занятие 6. ВЕКТОРНЫЕ СИСТЕМЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ В КЛЕТКАХ ПРОКАРИОТ И ЭУКАРИОТ. Занятие 6. ВЕКТОРНЫЕ СИСТЕМЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ В КЛЕТКАХ ПРОКАРИОТ И ЭУКАРИОТ. Цель занятия: ознакомиться с плазмидными, фаговыми и космидными векторами, освоить методы введения и клонирования

Подробнее

М.P.Кабилов 1, Г.М.Дымшиц 1, Д.В.Пышный 2, Е.М.Иванова 2, В.Ф.Зарытова 2, Н.М.Гашникова 3, А.Г.Покровский 3

М.P.Кабилов 1, Г.М.Дымшиц 1, Д.В.Пышный 2, Е.М.Иванова 2, В.Ф.Зарытова 2, Н.М.Гашникова 3, А.Г.Покровский 3 КОЛОРИМЕТРИЧЕСКАЯ ДЕТЕКЦИЯ ТОЧЕЧНЫХ МУТАЦИЙ ПРИ ИММОБИЛИЗАЦИИ ФРАГМЕНТА АНАЛИЗИРУЕМОЙ ДНК С ПРОДУКТОМ ЛИГИРОВАНИЯ НА НЕМ ТАНДЕМА КОРОТКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ М.P.Кабилов 1, Г.М.Дымшиц 1, Д.В.Пышный 2, Е.М.Иванова

Подробнее

Министерство образования Республики Беларусь УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ «ГРОДНЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ ЯНКИ КУПАЛЫ»

Министерство образования Республики Беларусь УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ «ГРОДНЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ ЯНКИ КУПАЛЫ» Министерство образования Республики Беларусь УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ «ГРОДНЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ ЯНКИ КУПАЛЫ» ОСНОВЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ (часть 1) Гродно 2009 УДК 54(075.8) ББК 24.1

Подробнее

Тема 1. Химический состав клетки Задания части А

Тема 1. Химический состав клетки Задания части А Тема 1. Химический состав клетки Задания части А Выберите один ответ, который является наиболее правильным 1. Назовите органические соединения, которые содержатся в клетке в наибольшем количестве (в %

Подробнее

Введение в молекулярную биологию (для информатиков) Александр Предеус Институт биоинформатики

Введение в молекулярную биологию (для информатиков) Александр Предеус Институт биоинформатики Введение в молекулярную биологию (для информатиков) Александр Предеус Институт биоинформатики Урок 1.1 Основные концепции молекулярной биологии молекулы, составляющие клетку биополимеры: ДНК, РНК, протеины

Подробнее

Методы исследования нуклеиновых кислот. I. Гибридизация

Методы исследования нуклеиновых кислот. I. Гибридизация Методы исследования нуклеиновых кислот I. Гибридизация Что можно исследовать? Первичная последовательность НК Одна из фундаментальных задач молекулярной биологии и биохимии Определенные мутации Пренатальная

Подробнее

«Автоматизация процесса пробоподготовки в ПЦР анализе»

«Автоматизация процесса пробоподготовки в ПЦР анализе» «Автоматизация процесса пробоподготовки в ПЦР анализе» Яцун Екатерина «Актуальные проблемы современной лабораторной диагностики» г. Барнаул, июнь 2010 г. Полимеразная цепная реакция (ПЦР): общие принципы

Подробнее

Резюме - краткое изложение информации по какому-либо изученному материалу. Необходимо изложить пройденную тему в 5-7 предложениях, используя термины.

Резюме - краткое изложение информации по какому-либо изученному материалу. Необходимо изложить пройденную тему в 5-7 предложениях, используя термины. Задания для внеаудиторной работы студентов специальности медицинская биохимия 1 курс. Резюме - краткое изложение информации по какому-либо изученному материалу. Необходимо изложить пройденную тему в 5-7

Подробнее

Структура работы: всего 19 заданий из них : 15 заданий- части А 2 задания части В и 2 задания части С

Структура работы: всего 19 заданий из них : 15 заданий- части А 2 задания части В и 2 задания части С КАРТА ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА ЗНАНИЙ БИОЛОГИЯ 9 класс (1 триместр) Проверяемые понятия и темы : Разделы биологии, раскрывающие общие закономерности организации, значение биологических знаний для познания окружающего

Подробнее

I. ЭКСПРЕСС-МЕТОД ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК Комплект реагентов для выделения ДНК «ПРОБА-РАПИД» 4 Комплект реагентов для выделения ДНК «ПРОБА-РАПИД-ГЕНЕТИКА» 5

I. ЭКСПРЕСС-МЕТОД ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК Комплект реагентов для выделения ДНК «ПРОБА-РАПИД» 4 Комплект реагентов для выделения ДНК «ПРОБА-РАПИД-ГЕНЕТИКА» 5 содержание I. ЭКСПРЕСС-МЕТОД ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК Комплект реагентов для выделения ДНК «ПРОБА-РАПИД» 4 Комплект реагентов для выделения ДНК «ПРОБА-РАПИД-ГЕНЕТИКА» 5 II. СОРБЕНТНЫЙ МЕТОД ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК Комплект

Подробнее

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ УТВЕРЖДАЮ Заместитель министра Главный государственный санитарный врач О.В.Арнаутов 24 декабря 2010 г. Регистрационный 096-0710 МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Подробнее

Encyclo Plus PCR kit

Encyclo Plus PCR kit Encyclo Plus PCR kit Набор реактивов Номер по каталогу PK101 Инструкция по применению Набор реактивов Encyclo Plus PCR kit предназначен только для исследовательских работ, выполняемых профессионально подготовленными

Подробнее

3. Область применения. Методика предназначена для использования в научноисследовательских и диагностических учреждениях ветеринарного профиля.

3. Область применения. Методика предназначена для использования в научноисследовательских и диагностических учреждениях ветеринарного профиля. 1. Введение Вирус гриппа является возбудителем острых респираторных заболеваний у человека и животных. Он принадлежит к семейству Orthomyxoviridae. Существует три типа вируса гриппа: A, B, C. Вирус типов

Подробнее

Нуклеиновые кислоты и их роль в жизнедеятельности клетки

Нуклеиновые кислоты и их роль в жизнедеятельности клетки Нуклеиновые кислоты Нуклеиновые кислоты и их роль в жизнедеятельности клетки Нуклеиновые кислоты открыты во второй половине 19 века швейцарским биохимиком Фридрихом Мишером Фридрих Мишер Нуклеиновые кислоты

Подробнее

Демонстрационный вариант контрольной работы для проведения промежуточной аттестации по биологии 10 класс

Демонстрационный вариант контрольной работы для проведения промежуточной аттестации по биологии 10 класс МОУ «Лицей 3 им. П.А. Столыпина г. Ртищево Саратовской области» Демонстрационный вариант контрольной работы для проведения промежуточной аттестации по биологии 10 класс 1.Развитие организма животного от

Подробнее

Учитель биологии ГБОУ СОШ 277 Кировского района Буянов А.В.

Учитель биологии ГБОУ СОШ 277 Кировского района Буянов А.В. Учитель биологии ГБОУ СОШ 277 Кировского района Буянов А.В. Название «нуклеиновые кислоты» происходит от латинского слова «нуклеус», т.е. ядро. Они впервые были обнаружены и выделены из ядер клеток. Этот

Подробнее

«МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ С ОСНОВАМИ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ»

«МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ С ОСНОВАМИ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ» МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФГБОУ ВПО «УЛЬЯНОВСКАЯ ГСХА им. П.А.Столыпина» Факультет ветеринарной медицины Кафедра биологии, ветеринарной генетики, паразитологии и экологии РАБОЧАЯ

Подробнее

Изд. «Вентана-Граф», 2013 г. Обязательный минимум упражнений. Содержание учебного материала. 1-17, вопросы после. С 1 сентября по 28 декабря.

Изд. «Вентана-Граф», 2013 г. Обязательный минимум упражнений. Содержание учебного материала. 1-17, вопросы после. С 1 сентября по 28 декабря. второе первое полугодия Тематическое планирование по биологии (экстерны) 2017-2018 учебный год 11 класс Учебник: Биология. 10 класс И.Н.Пономарева, О.А.Корнилова, Т.Е. Лощилина (базовый уровень), Изд.

Подробнее

Конкурсный открытый урок

Конкурсный открытый урок МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РБ ГАОУ СПО Нефтекамский нефтяной колледж Посвящается году охраны окружающей среды Конкурсный открытый урок На тему: Нуклеиновые кислоты Тема урока: Нуклеиновые кислоты Цели урока:

Подробнее

NON-RADIOACTIVELY LABELED OLIGO- AND POLYNUCLEOTIDE PROBES: TOOL FOR STUDYING GENOME STRUCTURE AND DIAGNOSTICS

NON-RADIOACTIVELY LABELED OLIGO- AND POLYNUCLEOTIDE PROBES: TOOL FOR STUDYING GENOME STRUCTURE AND DIAGNOSTICS НЕРАДИОАКТИВНО МЕЧЕНЫЕ ОЛИГО- И ПОЛИНУКЛЕОТИДНЫЕ ЗОНДЫ ИНСТРУМЕНТ ИЗУЧЕНИЯ СТРУКТУРЫ ГЕНОМА И ДИАГНОСТИКИ Г. М. ДЫМШИЦ Новосибирский государственный университет Дымшиц Г.М., 2001 NON-RADIOACTIVELY LABELED

Подробнее

Белорусский государственный университет

Белорусский государственный университет Белорусский государственный университет Генная инженерия Учебная программа (рабочий вариант) по специальности: 1-31 01 01 Биология (по направлениям) направление 1-31 01 01-03 Биология (биотехнология) Факультет

Подробнее

Методические рекомендации для самостоятельной работы обучающихся по дисциплине. Сельскохозяйственная биотехнология

Методические рекомендации для самостоятельной работы обучающихся по дисциплине. Сельскохозяйственная биотехнология ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ОРЕНБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» Методические рекомендации для самостоятельной

Подробнее

ПОДГОТОВКА К ГОСУДАРСТВЕННОМУ ЭКЗАМЕНУ ПО БИОЛОГИИ. Тема: «Энергетический и пластический обмен в клетках»

ПОДГОТОВКА К ГОСУДАРСТВЕННОМУ ЭКЗАМЕНУ ПО БИОЛОГИИ. Тема: «Энергетический и пластический обмен в клетках» Ярвеская русская гимназия ПОДГОТОВКА К ГОСУДАРСТВЕННОМУ ЭКЗАМЕНУ ПО БИОЛОГИИ Тема: «Энергетический и пластический обмен в клетках» I вариант 1. Рассмотрите рис. 1. Назовите этапы биосинтеза белка (I, II)

Подробнее

Комплексное решение для молекулярных исследований

Комплексное решение для молекулярных исследований Комплексное решение для молекулярных исследований Ведерников Виталий Евгеньевич, к.б.н., руководитель группы ПЦР Лаборатории молекулярной диагностики ООО «Вега» ГК «Алкор Био» http://forpcr.ru Taq M Hot-Start

Подробнее

Глава 8 Ген. 1. CS Понятие "ген" было предложено: a) Г. Менделем; b) Т. Морганом; c) В. Иогансеном; d) Дж. Уотсоном; e) О. Эйвери.

Глава 8 Ген. 1. CS Понятие ген было предложено: a) Г. Менделем; b) Т. Морганом; c) В. Иогансеном; d) Дж. Уотсоном; e) О. Эйвери. Глава 8 Ген 1. CS Понятие "ген" было предложено: a) Г. Менделем; b) Т. Морганом; c) В. Иогансеном; d) Дж. Уотсоном; e) О. Эйвери. 2. CS Выберите ответ не соответствующий характеристике гена: a) содержит

Подробнее

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «НИЖЕГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ имени Р.Е.

Подробнее

Белорусский государственный университет

Белорусский государственный университет Белорусский государственный университет «30» ноября 2016 г. Регистрационный УД - 3285 /уч. Технология рекомбинантных ДНК Учебная программа учреждения высшего образования по учебной дисциплине для специальности:

Подробнее

ПРОЦЕССИНГ ДНК И РНК 1. Репликация (от ДНК к ДНК) 2. Транскрипция (от ДНК к РНК)( 3. Трансляция (от РНК к белку) 4. Обратная транскрипция

ПРОЦЕССИНГ ДНК И РНК 1. Репликация (от ДНК к ДНК) 2. Транскрипция (от ДНК к РНК)( 3. Трансляция (от РНК к белку) 4. Обратная транскрипция ПРОЦЕССИНГ ДНК И РНК При жизни организма непрерывно происходят процессы обновления тканей, клеток и т.д., которые неизбежно включают процессы копирования и передачи информации, хранящейся в геноме. Направления

Подробнее

Ключевые методы молекулярной биологии. Секвенирование по Сенгеру. Докладчик: Шадрин Д.М.

Ключевые методы молекулярной биологии. Секвенирование по Сенгеру. Докладчик: Шадрин Д.М. Ключевые методы молекулярной биологии. Секвенирование по Сенгеру Докладчик: Шадрин Д.М. 1 История разработки метода Фридрих Мишер Николай Открытие ДНК Константинович 1869 год. Кольцов Структура ДНК, 1927

Подробнее

Ген - локус молекулы ДНК (цистрон), который включает в себя: структурную часть регуляторную часть

Ген - локус молекулы ДНК (цистрон), который включает в себя: структурную часть регуляторную часть Генный уровень организации наследственного материала. Ген - единица наследственной информации: занимающая определенное положение в хромосоме, контролирующая выполнение определенной функции, определяющая

Подробнее

Молекулярная диагностика возбудителей заболеваний картофеля

Молекулярная диагностика возбудителей заболеваний картофеля Молекулярная диагностика возбудителей заболеваний картофеля Владимир Карандашов, к.б.н. Руководитель лаборатории диагностики фитопатогенов ООО «Исследовательский центр «ФитоИнженерия» Московская область,

Подробнее

Молекулярная биология

Молекулярная биология Молекулярная биология Курс лекций для студентов IV курса факультета биологии РГПУ им. А.И. Герцена Профессор кафедры Зоологии, д.б.н., профессор Цымбаленко Надежда Васильевна Т Р А Н С К Р И П Ц И Я (прокариоты)

Подробнее

ррнк Рибосомальная РНК входит в состав рибосом, сложных надмолекулярных структур, которые состоят из четырех типов ррнк и нескольких десятков белков.

ррнк Рибосомальная РНК входит в состав рибосом, сложных надмолекулярных структур, которые состоят из четырех типов ррнк и нескольких десятков белков. ррнк Рибосомальная РНК входит в состав рибосом, сложных надмолекулярных структур, которые состоят из четырех типов ррнк и нескольких десятков белков. Рибосомальная РНК составляет большую долю (до 80%)

Подробнее

1. Аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы.

1. Аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы. В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от от 22 августа 2014 г. 14.604.21.0119 с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным

Подробнее

Что происходит в генетической лаборатории?

Что происходит в генетической лаборатории? 16 Что происходит в генетической лаборатории? Данная брошюра составлена при участии Dr Ian M Frayling, Institute of Medical Genetics, University Hospital of Wales, Cardiff, UK; Dr Domenico Coviello, Laboratory

Подробнее

Отложенные задания (30)

Отложенные задания (30) Отложенные задания (30) Вставьте в текст «ДНК» пропущенные термины из предложенного перечня, используя для этого цифровые обозначения. Запишите в текст цифры выбранных ответов, а затем получившуюся последовательность

Подробнее

УТВЕРЖДАЮ Зав. кафедрой молекулярной биологии и генетики, д.м.н. Топорков А.В. протокол 1 от «28» августа 2015 г.

УТВЕРЖДАЮ Зав. кафедрой молекулярной биологии и генетики, д.м.н. Топорков А.В. протокол 1 от «28» августа 2015 г. УТВЕРЖДАЮ Зав. кафедрой молекулярной биологии и генетики, д.м.н. Топорков А.В. протокол 1 от «28» августа 2015 г. Календарно - тематический план лекций по дисциплине «Методы и объекты генетического анализа»

Подробнее

НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ. БИОСИНТЕЗ ЛЕКЦИЯ 3

НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ. БИОСИНТЕЗ ЛЕКЦИЯ 3 НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ. БИОСИНТЕЗ ЛЕКЦИЯ 3 План лекции 1. РЕПЛИКАЦИЯ 2. ТРАНСКРИПЦИЯ РЕПЛИКАЦИЯ Лекция 3. БИОСИНТЕЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Словарь Реплисома мультиферментный комплекс (ДНКрепликазная система),

Подробнее

Тема «Молекулярные механизмы генетических процессов. Генетическая роль ДНК и РНК, ее доказательство» РЕПОЗИТОРИЙ БГПУ

Тема «Молекулярные механизмы генетических процессов. Генетическая роль ДНК и РНК, ее доказательство» РЕПОЗИТОРИЙ БГПУ Тема «Молекулярные механизмы генетических процессов. Генетическая роль ДНК и РНК, ее доказательство» Молекулярная генетика - раздел генетики и молекулярной биологии, изучающий материальные основы наследственности

Подробнее

РЕПЛИКАЦИЯ И РЕПАРАЦИЯ ДНК

РЕПЛИКАЦИЯ И РЕПАРАЦИЯ ДНК 7 РЕПЛИКАЦИЯ И РЕПАРАЦИЯ ДНК Репликация ДНК это молекулярный процесс точного копирования молекул ДНК (ее нуклеотидной последовательности). С помощью механизма репликации происходит точная передача генетической

Подробнее

Подготовка к ЕГЭ по биологии. Вальтер С.Ж. старший преподаватель кафедры ЕГТО БОУ ДПО «ИРООО»

Подготовка к ЕГЭ по биологии. Вальтер С.Ж. старший преподаватель кафедры ЕГТО БОУ ДПО «ИРООО» Подготовка к ЕГЭ по биологии Вальтер С.Ж. старший преподаватель кафедры ЕГТО БОУ ДПО «ИРООО» Анаболизм Центральная догма молекулярной биологии: ДНК РНК белок. Реакции матричного синтеза особая категория

Подробнее

Белорусский государственный университет

Белорусский государственный университет Белорусский государственный университет «30» июля 2015 г. Регистрационный УД 550 /уч. Молекулярная биотехнология Учебная программа учреждения высшего образования по учебной дисциплине для специальности:

Подробнее

10 класс. Контрольная работа по биологии 1 вариант

10 класс. Контрольная работа по биологии 1 вариант 10 класс Контрольная работа по биологии 1 вариант А1. Какой уровень организации живого служит основным объектом изучения цитологии? 1) Клеточный 2) Популяционно-видовой 3) Биогеоценотический 4) биосферный

Подробнее

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНТИКА

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНТИКА МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНТИКА МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ ДНК ЭУКАРИОТ Организм Количество репликонов Средний размер репликона, тыс.п.н. Скорость движения репликативной вилки, п.н./сек. 1 4200 50000 500 40

Подробнее

Министерство образования Республики Беларусь Учебно-методическое объединение вузов Республики Беларусь по естественнонаучному образованию

Министерство образования Республики Беларусь Учебно-методическое объединение вузов Республики Беларусь по естественнонаучному образованию Министерство образования Республики Беларусь Учебно-методическое объединение вузов Республики Беларусь по естественнонаучному образованию УТВЕРЖДАЮ /Первый з'а^с-титель Министра образования Генная инженерия

Подробнее

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. по проведению семинарских занятий по курсу

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. по проведению семинарских занятий по курсу 1 МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Подробнее

Тема: Молекулярные основы наследственности

Тема: Молекулярные основы наследственности Тема: Молекулярные основы наследственности План лекции: 1. Нуклеиновые кислоты классификация, строение, функции. 2. Макромолекулярная структура ДНК 3. РНК: виды, структура, функции Два вида НК: ДНК (хранение

Подробнее

Нуклеопротеины (ДНП и РНП) сложные белки, небелковым компонентом которых являются нуклеиновые кислоты (РНК и ДНК). Нуклеиновые кислоты (от лат.

Нуклеопротеины (ДНП и РНП) сложные белки, небелковым компонентом которых являются нуклеиновые кислоты (РНК и ДНК). Нуклеиновые кислоты (от лат. Нуклеопротеины (ДНП и РНП) сложные белки, небелковым компонентом которых являются нуклеиновые кислоты (РНК и ДНК). Нуклеиновые кислоты (от лат. Nucleus ядро) это полинуклеотиды, неразветвленные и нерегулярные,

Подробнее

Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и онкологических заболеваний. Филатова Людмила К.б.н Менеджер по продукции

Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и онкологических заболеваний. Филатова Людмила К.б.н Менеджер по продукции Новые технологии в молекулярной диагностике инфекционных, наследственных и Филатова Людмила К.б.н Менеджер по продукции Генетические технологии не роскошь, а средство Основные направления развития диагностических

Подробнее

Цель занятия: ознакомиться с процессами репликации ДНК.

Цель занятия: ознакомиться с процессами репликации ДНК. Занятие 3. РЕПЛИКАЦИЯ ДНК Цель занятия: ознакомиться с процессами репликации ДНК. 1 Матричные процессы синтеза биополимеров. Белки и ферменты, участвующие в репликации ДНК. Общая характеристика репликации

Подробнее

ВВЕДЕНИЕ В ОБМЕН ВЕЩЕСТВ И ЭНЕРГИИ

ВВЕДЕНИЕ В ОБМЕН ВЕЩЕСТВ И ЭНЕРГИИ ВВЕДЕНИЕ В ОБМЕН ВЕЩЕСТВ И ЭНЕРГИИ Жизнедеятельность организмов включает: а) обмен веществ и энергии; б) передача генетической информации; в) механизмы регуляции. Нарушение любого звена приводит к патологии.

Подробнее

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. ПРОЦЕССИНГ РИБОСОМАЛЬНЫХ И ТРАНСПОРТНЫХ РНК. синтез молекул РНК, образование первичного транскрипта (пре-рнк) (посттранскрипционные модификации) модификация

Подробнее

Структурами, которые несут генетическую информацию, являются нуклеиновые кислоты

Структурами, которые несут генетическую информацию, являются нуклеиновые кислоты Организация наследственного материала (I) Вопросы: 1. Строение и функции нуклеиновых кислот. 2. Репликация ДНК. 3. Генетический код и его свойства. 4. Реализация генетической информации в клетке. Биосинтез

Подробнее

4. Перечень разделов и (или) тем дисциплины и их дидактическое содержание. История развития биотехнологии и ОПК-11,

4. Перечень разделов и (или) тем дисциплины и их дидактическое содержание. История развития биотехнологии и ОПК-11, 1. Целью изучения дисциплины является: ознакомление студентов с современным состоянием медицинской биотехнологии; формирование у студентов системных знаний по фундаментальным понятиям биомедицинской науки;

Подробнее

ОРГАНИЗАЦИЯ НАСЛЕДСТВЕННОГО МАТЕРИАЛА

ОРГАНИЗАЦИЯ НАСЛЕДСТВЕННОГО МАТЕРИАЛА Занятие 6. Тема: ОРНИЗИЯ НСЛЕДСТВЕННОО МТЕРИЛ (занятие I) " " 200 г ель занятия: изучить молекулярную природу гена, его свойства; научиться решать задачи, раскрывающие строение молекул ДНК и РНК, по репликации,

Подробнее

ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА

ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА Подготовка высококвалифицированных специалистов-биологов требует овладения ими знаний в различных областях современной биологии. Наиболее развивающейся областью биологической науки

Подробнее

Лабораторная работа 12. ОСНОВЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ

Лабораторная работа 12. ОСНОВЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ Лабораторная работа 12. ОСНОВЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ Цель занятия: ознакомиться с основными инструментами генетической инженерии ферментами рестрикции, ДНК-лигазой и способами получения гибридной ДНК

Подробнее

Комплементарный тест и функция гена

Комплементарный тест и функция гена ГЕНЕТИКА 2 лекция проф. Крис Кайзер Комплементарный тест и функция гена Данная лекция знакомит с экспериментами над дрожжами, а также дает функциональное определение термина «Ген». Prof. Chris Kaiser GENETICS

Подробнее

Глоссарий. Генетически модифицированные (трансгенные организмы, ГМО, ТГО) ГЕНЕТИЧЕСКИ ИЗМЕНЕННЫЙ ОРГАНИЗМ (ГИО)

Глоссарий. Генетически модифицированные (трансгенные организмы, ГМО, ТГО) ГЕНЕТИЧЕСКИ ИЗМЕНЕННЫЙ ОРГАНИЗМ (ГИО) Глоссарий ГМ Генетически модифицированные (трансгенные организмы, ГМО, ТГО) ГЕНЕТИЧЕСКИ ИЗМЕНЕННЫЙ ОРГАНИЗМ (ГИО) Генная инженерия (молекулярная биотехнология, молекулярное клонирование) генно-инженерная

Подробнее

Радикальная замена аминокислоты мутационная замена, приводящая к значительным изменениям структуры и функции белка. Рамка считывания один из трех

Радикальная замена аминокислоты мутационная замена, приводящая к значительным изменениям структуры и функции белка. Рамка считывания один из трех Р Радикальная замена аминокислоты мутационная замена, приводящая к значительным изменениям структуры и функции белка. Рамка считывания один из трех возможных способов считывания нуклеотидной последовательности

Подробнее

Демонстрационная работа по биологии 10 класса. 1семестр. 1вариант

Демонстрационная работа по биологии 10 класса. 1семестр. 1вариант Демонстрационная работа по биологии 10 класса 1семестр 1вариант 1. Генеалогический метод используют для 1) получения генных и геномных мутаций 2) изучения влияния воспитания на онтогенез человека 3) исследования

Подробнее

Решение заданий по разделу «Молекулярная биология» при подготовке учащихся к ЕГЭ

Решение заданий по разделу «Молекулярная биология» при подготовке учащихся к ЕГЭ Решение заданий по разделу «Молекулярная биология» при подготовке учащихся к ЕГЭ. учитель биологии МБОУ СОШ 44 г. Сургута Семерез Ольга Борисовна Молекулярная биология изучает механизмы хранения и передачи

Подробнее

ОКО (отрицательный контрольный образец) для исключения ложноположительных результатов;

ОКО (отрицательный контрольный образец) для исключения ложноположительных результатов; СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ РАСПРОСТРАНЕННОСТИ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ МИКОПЛАЗМ Г.П. Погосян, А.А. Коновалова, В.В. Акимова Карагандинский Государственный Университет имени академика Е.А. Букетова Караганда, Казахстан

Подробнее

Александр Вячеславович Качан, доцент кафедры молекулярной биологии Белорусского государственного университета, кандидат биологических наук

Александр Вячеславович Качан, доцент кафедры молекулярной биологии Белорусского государственного университета, кандидат биологических наук Учебная программа составлена на основе ОСВО 1-31 01 01-2013, ОСВО 1-31 01 03-2013, типовой учебной программы ГЕННАЯ ИНЖЕНЕ- РИЯ. ТД-G. 531/тип. 2015 г. и учебных планов УВО G31-129/уч. 2013 г., G31-131/уч.

Подробнее

«МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»

«МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ» ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНАЯ (ОБЩЕРАЗВИВАЮЩАЯ) ПРОГРАММА «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ» Направленность: естественнонаучная Уровень программы - базовый Возраст обучающихся - 15-18 лет Срок реализации программы

Подробнее

БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОТЦОВСТВО

БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОТЦОВСТВО БИОЛОГИЧЕСОЕ ОТЦОВСТВО олекулярно-генетическое исследование биологического отцовства На основании сопроводительного письма к биологическим образцам на молекулярно-генетическое исследование отцовства врач-генетик

Подробнее

Глава 9 Транскрипция и процессинг РНК

Глава 9 Транскрипция и процессинг РНК Глава 9 Транскрипция и процессинг РНК 1. СS Кэпирование про-мрнк обеспечивает: a) репликацию ДНК; b) репарацию ДНК; c) стабильность молекул РНК; d) денатурацию ДНК; e) сплайсинг. 2. CS В транскрипции участвует:

Подробнее

Tornado Taq-полимераза (hot-start)

Tornado Taq-полимераза (hot-start) Tornado Taq-полимераза (hot-start) Tornado Taq-полимераза является уникальным ферментом, обладающим повышенной термостабильностью, устойчивостью к ингибиторам ПЦР и повышенной скоростью синтеза ДНК по

Подробнее

УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ. Институт биохимической технологии и нанотехнологии (ИБХТН)

УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ. Институт биохимической технологии и нанотехнологии (ИБХТН) БИЛЕТ 1 1. История развития биотехнологии и основные ее аспекты. 2. Рекомбинантные молекулы ДНК, их получение и использование. 3. Непрерывное культивирование микроорганизмов. Хемостатный метод культивирования.

Подробнее

Разработка и коммерциализация спектро-секвенатора ДНК и РНК.

Разработка и коммерциализация спектро-секвенатора ДНК и РНК. Разработка и коммерциализация спектро-секвенатора ДНК и РНК. Более 50 лет назад Нобелевский лауреат Ричард Фейнман на лекции в Стэндфордском университете сказал то, что во многом справедливо и сегодня.

Подробнее

4. Канцерогенез. 5. Кольцевые хромосомы. 6. Норма реакции. 7. "Сдвиг рамки считывания" 8. Транзиции. 9. Трансверзии ОСНОВНЫЕ ТЕРМИНЫ И ПОНЯТИЯ

4. Канцерогенез. 5. Кольцевые хромосомы. 6. Норма реакции. 7. Сдвиг рамки считывания 8. Транзиции. 9. Трансверзии ОСНОВНЫЕ ТЕРМИНЫ И ПОНЯТИЯ Занятие 12. Тема: ИЗМЕНЧИВОСТЬ " " 200 г Цель занятия: изучить основные формы изменчивости, их причины, медицинскую и биологическую значимость; знать механизмы генных, хромосомных и геномных мутаций, репарацию

Подробнее

Использование генетики

Использование генетики Использование генетики БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ И ДНК ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГЕНЕТИКИ Глава 1: Клонирование Что такое клон? Клон это организм, генетически идентичный другому организму. Клоны появляются естественным путём

Подробнее

Методы изучения РНК. Изучение регуляторных участков ДНК. Прикладное применение NGS

Методы изучения РНК. Изучение регуляторных участков ДНК. Прикладное применение NGS Методы изучения РНК. Изучение регуляторных участков ДНК. Прикладное применение NGS 1. Молекулярные методы Анализ РНК можно проводить по следующим категориям: первичная структура (последовательность нуклеотидов),

Подробнее

КАТАЛОГ ОБОРУДОВАНИЯ

КАТАЛОГ ОБОРУДОВАНИЯ КАТАЛОГ ОБОРУДОВАНИЯ КОМПАНИЯ «ДНК-ТЕХНОЛОГИЯ» КАТАЛОГ ОБОРУДОВАНИЯ Москва 2017 1 СОДЕРЖАНИЕ ТЕКУЩИЕ ИЗМЕНЕНИЯ И ДОПОЛНЕНИЯ ВВЕДЕНИЕ О КОМПАНИИ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ТЕХНОЛОГИИ I. ПЦР СОВРЕМЕННЫЙ МЕТОД КЛИНИЧЕСКОЙ

Подробнее

ДНК - Технология ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

ДНК - Технология ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ МОСКВА 1998 2 Введение...3 1. Перспективы практического использования ПЦР-диагностики...5 2. Механизм полимеразной цепной реакции...6 2.1. Компоненты реакционной

Подробнее

Задания А36 по биологии

Задания А36 по биологии Задания А36 по биологии 1. Верны ли следующие суждения? А. Кроссинговер способствует сохранению наследственной информации при делении соматических клеток. Б. Геномные мутации ведут к возникновению наследственных

Подробнее

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН Западно-Казахстанский государственный университет им.м.утемисова РАБОЧАЯ УЧЕБНАЯ ПРОГРАММА MONI 1101 Молекулярные основы наследственности и изменчивости

Подробнее

2. Готовыми органическими веществами питаются организмы

2. Готовыми органическими веществами питаются организмы ТЕМА «Пластический обмен» 1. Готовыми органическими веществами питаются 1) грибы 2) папоротники 3) водоросли 4) мхи 2. Готовыми органическими веществами питаются организмы 1) автотрофы 2) гетеротрофы 3)

Подробнее

ОСНОВЫ ГЕНЕТИКИ ЧЕЛОВЕКА

ОСНОВЫ ГЕНЕТИКИ ЧЕЛОВЕКА Занятие 14. Тема: ОСНОВЫ ГЕНЕТИКИ ЧЕЛОВЕКА (занятие ) " " 200 г Цель занятия: изучить задачи генетики человека на современном этапе, основные методы генетики человека; научиться решать задачи по составлению

Подробнее

Синтез ДНК Реализация наследственной информации. Заведующий кафедрой биологии, профессор Колесников О.Л.

Синтез ДНК Реализация наследственной информации. Заведующий кафедрой биологии, профессор Колесников О.Л. Синтез ДНК Реализация наследственной информации Заведующий кафедрой биологии, профессор Колесников О.Л. Особенности ДНК-полимеразы Синтез новой цепи идет в направлении от 5 к 3 концу цепи Фермент может

Подробнее

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ КЛЕТКИ

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ КЛЕТКИ МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ УКРАИНЫ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ «Харьковский политехнический институт» А.Н. Огурцов МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ КЛЕТКИ Учебное пособие по курсу «Молекулярная

Подробнее

Лото «Химический состав клетки» (игра для 10 класса)

Лото «Химический состав клетки» (игра для 10 класса) МОУ «Грабцевская средняя общеобразовательная школа» МР «Ферзиковский район» Лото «Химический состав клетки» (игра для 10 класса) Подготовила Учитель биологии Грищенко О.В. Лото «Химический состав клетки»

Подробнее