ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ

Save this PDF as:
 WORD  PNG  TXT  JPG

Размер: px
Начинать показ со страницы:

Download "ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ"

Транскрипт

1 ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» А.Т. Епринцев, В.Н. Попов, Д.Н. Федорин ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ Учебно-методическое пособие для вузов Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета 2008

2 Утверждено научно-методическим советом биолого-почвенного факультета 14 февраля 2008 г., протокол 6 Рецензент доктор биологических наук, профессор М.А. Наквасина Учебно-методическое пособие подготовлено на кафедре физиологии и биохимии растений биолого-почвенного факультета Воронежского государственного университета. Рекомендуется для студентов 3 и 4 курсов дневного обучения биологопочвенного факультета. Для специальности Биология 2

3 Оглавление Раздел 1. Методы работы с нуклеиновыми кислотами Глава I. Выделение и очистка нуклеиновых кислот Работа 1. Методика выделения РНК методом фенол-хлороформной экстракции в присутствии хлорида лития Работа 2. Методика выделения геномной ДНК с использованием СТАВ Работа 3. Методика быстрого выделения РНК из грамм (-) бактерий. 12 Работа 4. Методика экстракции ДНК из агарозного геля с использованием наборов фирмы QIAEX II Глава II. Определение качественных и количественных показателей нуклеиновых кислот Работа 5. Определение концентрации ДНК или РНК Работа 6. Определение чистоты препарата ДНК или РНК Работа 7. Методика электрофореза нуклеиновых кислот в агарозном геле Раздел 2. Методы анализа нуклеиновых кислот.... Глава I. Обратная транскрипция Работа 8. Методика проведения обратной транскрипции с использованием фермента M-MuLV Reverse Transcriptase Глава II. Полимеразная цепная реакция Работа 9. Методика проведения полимеразной цепной реакции Глава III. Полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-Time PCR) Работа 10. Методика амплификации с использованием красителя SYBR Green Работа 11. Методика амплификации ДНК с применением зондов Taqman Работа 12. Обработка данных Глава IV. Гибридизация нуклеиновых кислот

4 Работа 13. Использование биотин-11-dutp для нерадиоактивного мечения ДНК методом ПЦР Работа 14. Использование биотин-11-dutp для нерадиоактивного мечения ДНК методом удлинения затравки Работа 15. Проведение гибридизации ДНК по Саузерну Работа 16. Выявление меченых ДНК с образованием нерастворимого окрашенного продукта Работа 17. Дот-блот-гибридизация ПЦР-амплифицированной ДНК Глава V. Клонирование ДНК в бактериальные системы Работа 18. Приготовление компетентных клеток Работа 19. Трансформация бактериальных клеток методом «холодового шока» Работа 20. Выделение плазмидной ДНК (лизис щелочью) Работа 21. Выделение плазмидной ДНК методом фенол-хлороформной экстракции (экспресс-метод) Работа 22. Определение вставки ДНК в трансформированных клетках методом рестрикции Работа 23. Идентификация вставки ДНК в трансформированных клетках методом ПЦР

5 Раздел 1. Методы работы с нуклеиновыми кислотами Исследования в области молекулярной биологии связаны с целенаправленным манипулированием фрагментами нуклеиновых кислот (НК) или целыми генетическими конструкциями, целью которых является получение с помощью лабораторных методов организмов с новыми, в том числе и не встречающимися в природе, комбинациями наследственных свойств. Таким образом, изменение наследственных свойств организма с помощью генной инженерии сводится к конструированию из различных фрагментов нового генетического материала, введения этого материала в рецепиентный организм, создания условий для его функционирования и исследования его уровня экспрессии. В основе молекулярной биологии лежат современные методы физико-химической биологии. Данные методы позволяют получать в чистом виде генетический материал клетки, проводить с ним различные манипуляции, позволяющие идентифицировать как отдельные компоненты, так и целый геном организма. Важным в изучении функционирования живого организма является исследование функциональной активности генетического материала клетки. На первой стадии проведения анализа проба подвергается специальной обработке, в результате которой происходит лизис клеточного материала, удаление белковых и полисахаридных фракций и получение раствора ДНК или РНК, свободного от ингибиторов и готового для дальнейшей амплификации. Выбор методики выделения ДНК (РНК) в основном определяется характером используемого материала. В зависимости от типа биологического материала лизис клеток осуществляется различными способами. Клетки биоматериала разрушаются различными способами, наиболее часто используемым из которых является механическое разрушение. Часто (в случае работы с растительными и 5

6 бактериальными клетками) возникает необходимость применения дополнительных компонентов для избавления от клеточной стенки (лизирующие ферменты, детергенты и т. д.). После разрушения образца возникает необходимость очистки нуклеиновых кислот от других компонентов клеток. Для этого существуют различные методы, основанные на специфических свойствах нуклеиновых кислот. Наиболее часто используется очистка НК методом фенолхлороформной экстракции, основанной на различной растворимости НК в растворителях разной природы. Кроме того, применяются методы, основанные на способности НК адсорбироваться на специфических носителях с последующей их элюцией. Глава I. Выделение и очистка нуклеиновых кислот Метод стал широко использоваться для выделения НК из биологических образцов различных источников. Данный метод позволяет выделять в чистом виде не только суммарною вытяжку НК, но и разделить между собой ДНК и РНК. Принципиальная основа метода заключается в том, что НК имеет высокую растворимость в водной фазе, в то время как большая часть белков, углеводов и других компонентов клетки растворяются в органических растворителях. На первой стадии происходит суммарное выделение РНК и ДНК, в присутствии гуанидин изотиоционата, ацетата натрия и других компонентов. Гуанидин изотиоционат один из самых мощных денатурантов белка. Очень эффективен при очистке РНК из-за его способности быстро проникать в клетки и подавлять активность РНКаз. Гуанидин изотиоционат, используемый комбинации со смесью фенол-хлороформ и осаждением спирта, что обеспечивает получение качественной неповрежденной РНК. Кроме того, вместо гуанидин изотиоцианата часто используется додецилсуль- 6

7 фат натрия, также вызывающий лизис клеток и ингибирование клеточных нуклеаз. Применение фенола и хлороформа при выделении НК способствует созданию двухфазной системы. Фенол отделяет белки от ДНК. Хлороформ денатурирует белок и липиды и помогает поддерживать разделение органической и водной фазы, а также делает ДНК менее растворимой в феноле. При ph 7 8, происходит растворение ДНК и РНК в водной фазе, в то время как белки образуют непрозрачный слой между фазами. В кислых условиях (рн < 5), суммарная РНК остается в верхней водной фазе, в то время как большая часть ДНК и белков остается или в интерфазе, или в органической фазе. Суммарная РНК впоследствии может быть выделена осаждением с изопропиловым спиртом. Регулируя содержание фенола и его ph, можно добиться разделения ДНК и РНК между собой, при этом ДНК будет находиться в органической фазе, в то время как РНК будет в водной фазе. На данной стадии возможно добавление изоамилового спирта, чтобы предотвратить вспенивание. Добавление одновалентных катионов (K, Na, NH 4 ) при выделении НК приводит к формированию соли с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами. Добавление спирта (этанол или изопропиловый спирт) приводит к обратимой денатурации нуклеиновых кислот. LiCl часто использовался, чтобы денатурировать РНК, хотя осаждение со спиртом и одновалентным катионом типа натрия или иона аммония намного более широко используется. Осаждение LiCl имеет преимущества перед другими методами осаждения РНК, в которых не происходит эффективного удаления ДНК, белок или углеводы. Другое преимущество состоит в том, что литиевое осаждение эффективно удаляет несвязанные нуклеотидфосфаты, которые учитываются при количественном анализе концентрации методом спектрофотометрии. 7

8 Рис. 1. Схематичный процесс выделения нуклеиновых кислот методом фенол-хлороформной экстракции Существует и иной способ экстракции нуклеиновых кислот, в основе которого лежит способность ДНК и РНК сорбироваться на различного рода носителях (пористое стекло, силикагель, смолы и др.). Принцип данного метода заключается в сорбции НК на носителе за счет слабых связей (водородные связи, электростатические силы, бисульфидные мостики и т. д.), и последующей их элюцией солевыми растворами с высокой ионной силой. На основе использования магнитных частиц или других сорбентов на поверхности которых имеются ковалентно связанные poly-т олигонуклеотидные последовательности разной длины, можно выделять чистые препараты мрнк для исследования экспрессионной активности генома образцов. 8

9 Рис 2. Схема выделения нуклеиновых кислот с использованием различного рода сорбентов Работа 1. Методика выделения РНК методом фенол-хлороформной экстракции в присутствии хлорида лития 1. Растворить образец ткани в буфере D (4M гуанидин изотиоционат, 30 мm цитрат натрия, 30 мm β-меркаптоэтанол, ph ). 9

10 2. Поместить пробирку на лёд. Добавить один объём фенола и перемешать. Добавить 1/5 объёма смеси хлороформ : изоамиловый спирт (24 : 1) и перемешать образец. Перемешать на вортексе ещё 4 раза по 1 мин. Между перемешиваниями пробирки инкубировать на льду. 3. Открутить на максимальной скорости при 4 С в течение 30 мин. Верхнюю (водную) фазу перенести в новую пробирку. 4. Добавить 1 мкл соосадителя и 2 объёма 96 % этанола. Перемешать на вортексе и немедленно открутить на максимальной скорости при RT в течение 10 мин. 5. Промыть осадок 80 % этанолом и высушить на воздухе до исчезновения следов спирта. Не пересушивать!!! 6. Растворить осадок в 100 мкл деионизованной воды. Добавить равный объём 12М LiCl и охладить раствор в течение 30 мин при 20 С. 7. Открутить на максимальной скорости 15 мин при комнатной температуре. Промыть осадок 0.8 мл 80 % этанола. 8. Осадок высушить, как описано ранее, и растворить в 40 мкл деионизованной воды, свободной от РНКаз. 9. Определить концентрацию и чистоту полученного препарата РНК. Комментарии к методике: 1) Объем ткани не должен превысить 1/5 объема буфера D. Чтобы избегать деградации РНК, гомогенизация ткани должна быть выполнена так быстро и полностью, насколько возможно. 2) При выделении РНК может происходить загрязнение геномной ДНК. Однако, если ее количество не превышает по свечению РНК в агарозном геле с бромистым этидием, такое загрязнение не является критичным и дает возможность использовать полученный препарат РНК в дальнейшем. 3) Для хранения выделенной РНК, добавьте 0.1 объема 3М ацетата натрия и 2.5 объемов 96 % этанола к РНК в воде и смешайте полностью. Образец может быть сохранен в течение нескольких лет в 20 C. 10

11 Работа 2. Методика выделения геномной ДНК с использованием СТАB 1. Ткань растереть в ступке на холоде. 2. Перенести растертую ткань в прогретую до 65 о С пробирку с 2x CTAB (из расчёта 25 мл 2x CTAB (CTAB - 2% (w/v), 1.4M NaCI, 0.1М Tris-НCI, ph 8.0, 20mM ЭДТА, довести dн 2 О) на 2 5 г ткани), очень хорошо и быстро перемешать. 3. Инкубировать при 65 о С минимум 20 мин (лучше 1 час). 4. Охладить до комнатной температуры, добавить равный объём хлороформа : изоамилового спирта (24 : 1), перемешивать и оставить инкубироваться на 20 мин. 5. Центрифугировать на rpm при комнатной температуре 10 мин. 6. Снять водную фазу, добавить к ней 0.2 объема 5x CTAB (CTAB 5 % (w/v), 350mM ЭДТА, довести dн 2 О), перемешать и инкубировать при 65 о С 10 мин. 7. Добавить равный объём хлороформ : изоамиловый спирт, инкубировать 1 мин, периодически перемешивая. 8. Центрифугировать на rpm при комнатной температуре 10 мин. 9. Добавить равный объём буфера для преципитации (CTAB 1 % (w/v), 0.05М Tris-НCI, ph 8.0, 10mM ЭДТА, довести dн 2 О) (можно и 2 3 объёма), перемешать и оставить на 1 час при комнатной температуре. 10. Центрифугировать rpm при комнатной температуре 20 мин. 11. Растворить осадок в 1 2 мл HS-TE буфере (1M NaCI, 0.01М Tris- НCI, ph 8.0, 1mM ЭДТА, довести dн 2 О); добавить 2 объема 96 % этанол и инкубировать 1 час при 20 о С или 30 мин при 70 о С. 12. Центрифугировать rpm при 4 о С 10 мин. 11

12 13. К осадку добавить 200 мкл дистиллированной H 2 O и 100 мкл 7.5M NH 4 Ac (ph 7.5) и инкубировать 20 мин при 0 о С. 14. Центрифугировать rpm при 4 о С 10 мин, добавить к супернатанту 2 объема 96 % этанол и инкубировать 20 мин при 70 о С. 15. Центрифугировать rpm при 4 о С 10 мин, осадок сполоснуть 80 % этанолом; 16. Растворить в TE буфере или dh 2 O; 17. Хранить при 20 о С. Комментарии к методике: 1) Если количество ткани небольшое, удобнее добавлять буфер непосредственно в ступку. Для совсем маленьких образцов используется пестик для микроцентрифужных пробирок. 2) Экстракция хлороформом может уменьшить объём водной фазы. В таких случаях требуется добавить 1х CTAБ буфер до исходного объёма. Работа 3. Методика быстрого выделения РНК из грамм (-) бактерий 1. Осадить клетки из 10 мл культуры центрифугированием rpm при 4 о С 10 мин. Ресуспендировать в 10 мл буфера (15мМ Трис-HCI рн 8.0, 0.45М сахароза, 8мМ ЭДТА), добавить 80 мкл (50мг/мл) лизоцима и инкубировать на льду 15 мин. 2. Центрифугировать протопласты 5 мин rpm при 4 о С. Ресуспендировать в 0.5 мл лизирующего буфера (10мМ Трис-HCI рн 8.0, 10мМ NaCI, 1мМ цитрат натрия, 1.5 % (w/v) SDS). Инкубировать 5 мин при 37 о С, затем охладить на льду. 3. Добавить 250 мкл насыщенного хлорида натрия, перемешать. Инкубировать 10 мин на льду. 12

13 4. Центрифугировать на максимальной скорости. Супернатант перенести в новую пробирку и добавить 1 мл охлажденного 96 % этанола. Инкубировать 30 мин при 70 о С. 5. Центрифугировать 15 мин на максимальной скорости при 4 о С. Промыть осадок охлажденным 70 % этанолом и подсушить. 6. Растворить в подходящем объеме ( мкл) деионизованной Н 2 О. Хранит при 70 о С. Комментарии к методике: 1) После лизиса клеток образуется вязкая масса, поэтому необходимо осторожно отбирать водную фазу, чтобы исключить загрязнение НК белками. 2) приготовление насыщенного раствора хлорида натрия лучше осуществлять с использованием DEPC-воды, что уменьшает риск внесения экзогенных нуклеаз. 3) Осаждение РНК 96% этанолом можно проводить и при 20 о С, увеличив при этом время инкубации до часов. Работа 4. Методика экстракции ДНК из агарозного геля с использованием наборов фирмы QIAEX II. 1. Вырезать фрагмент геля с ДНК, взвесить его и добавить 3 объема буфера QX Размешать QIAEX II на вортексе 30 с. Прибавить мкл QIAEX II. Перемешать на вортексе. 3. Инкубировать 10 мин при 50 о С. Мешать на вортексе каждые 2 минуты. 4. Центрифугировать 30 с при rpm, удалить супернатант. 5. К осадку добавить 500 мкл буфера QX 1 и перемешать на вортексе. Центрифугировать 30 с, отобрать весь супернатант. 6. Добавить к осадку 500 мкл буфера PE. Перемешать на вортексе. Центрифугировать 30 с при rpm, отобрать весь супернатант. 13

14 7. Осадок сушить в течение мин. Прибавить мкл dн 2 О и перемешать на вортексе. Инкубировать при комнатной температуре 5 мин. 8. Центрифугировать 30 с при rpm. Перенести супернатант в новую пробирку. 9. Повторить п. 9 и 10. Долить супернатант в ту же пробирку. 10. Хранить при 20 о С. Комментарии к методике: 1) ДНК из геля необходимо вырезать как можно точнее. Кроме того, нельзя долгое время светить на гель ультрафиолетом, поскольку ДНК может пришиться к гелю. 2) Буфер PE желательно готовить непосредственно перед использованием. Для его приготовления 100 мкл необходимо взять 20 мкл раствора PE из набора и прибавить 80 мкл 96% этанола. 3) При подсушивании осадка в п. 7 важно не пересушить его, поскольку в длинных молекулах ДНК могут образоваться разрывы, что значительно ухудшит качество препарата. Глава II. Определение качественных и количественных показателей нуклеиновых кислот Метод определения концентрации нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) в растворе основан на существовании у ДНК и РНК максимума поглощения при длине волны 260 нм (рис. 3). Это означает, что в растворах нуклеиновых кислот максимальная фотометрическая абсорбция наблюдается при 260 нм и прямо коррелирует с концентрацией ДНК или РНК. 14

15 Рис. 3. Спектр поглощения нуклеиновых кислот при разных длинах волн Работа 5. Определение концентрации ДНК или РНК При постановке измерения образец ДНК разбавляют дистиллированной водой в 40 раз (к 5 мкл раствора ДНК добавляют 195 мкл воды). Измерение поглощения при 260 нм проводят в кювете с длиной оптического пути 1 мм, используя воду в качестве контроля. Значение концентрации ДНК в исходном растворе (мкг/мкл) находят, умножая значение поглощения при длине волны 260 нм на К = 20 (К молекулярный коэффициент экстинкции). [ДНК] = А 260 К РНК разбавляют водой в 10 раз (к 20 мкл раствора ДНК добавляют 180 мкл воды). Измерение поглощения при 260 нм проводят в кювете с длиной оптического пути 1 мм, используя воду в качестве контроля. Значение концентрации РНК в исходном растворе (мкг/мкл) находят, умножая значение поглощения при длине волны 260 нм на К = 4 (К молекулярный коэффициент экстинкции). [РНК] = А 260 К 15

16 Работа 6. Определение чистоты препарата ДНК или РНК Отношение поглощения при длинах волн 260 нм и 280 нм ( нм) показывает чистоту препарата ДНК или РНК. Препарат считается чистым, если отношение значений 260 / 280 нм приблизительно равно 1.8 для ДНК и 2.8 для РНК. В случае меньших значений показателя нм препарат содержит большое количество примесей белка, фенола или иных контаминирующих агентов, имеющих значительное поглощение при 280 нм. ДНК 16 РНК А 260 /А 280 = 1.8 А 260 /А 280 = 2.8 Другим показателем чистоты препарата ДНК или РНК является отношение значений поглощения нм. В случае чистого препарата это соотношение обычно равно Меньшие значения коэффициента 260/230 нм свидетельствуют о загрязнении препарата компонентами, которые остаются после процедуры выделения ДНК или РНК. А А230 Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле Для нуклеиновых кислот широко применяется метод гельэлектрофореза. Его принцип заключается в следующем. Исследуемый препарат (раствор ДНК или РНК) вносят в лунку, расположенную у края геля. Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, и когда через гель пропускают электрический ток, они перемещаются в электрическом поле. Для учета результатов выделения нуклеиновых кислот среднего размера обычно применяют агарозные гели в присутствии специфического

17 красителя (как правило, бромистый этидий или SYBR Green I). Для фракционирования более крупных молекул ДНК (миллионы пар оснований) денатурированной ДНК и РНК приходится использовать специальные системы электрофореза. Иногда для решения специальных задач для разделения ДНК применяют полиакриламидные гели. Так, в 20 % полиакриламидном геле можно разделить фрагменты ДНК, состоящие всего из шести оснований и различающиеся лишь одним нуклеотидом. Детекция НК основана на использовании интеркалирующих веществ, активирующих свою способность к флуоресценции в результате присоединения к ДНК или РНК. В качестве основного представителя применяется бромистый этидий и SYBR Green I. Этот способ детекции основан на том факте, что флуоресценция бромистого этидия под действием ультрафиолетового излучения значительно возрастает при их внедрении в двухцепочечные молекулы ДНК. Однако он способен взаимодействовать и с молекулами РНК, но менее интенсивно. Рис. 4. Механизм детекции ДНК с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green I 17

18 Для разделения нуклеиновых кислот применяют различные концентрации геля, в зависимости от длины исследуемой НК. Диапазон нормального разделения линейных ДНК молекул для гелей с различной концентрацией агарозы приведен в таблице. Таблица 1 Зависимость разделения линейных молекул ДНК от концентрации агарозного геля % агарозы Размер ДНК [kbp] Работа 7. Методика электрофореза нуклеиновых кислот в агарозном геле 1. Взвесить необходимое количество агарозы (ее количество зависит от концентрации используемого геля). 2. Долить 1х ТАЕ буфер до нужного объёма (можно использовать концентрированный 50х ТАЕ буфер (2М Tris-HCI, 5.71 % ледяной уксусной кислоты, 2мМ EDТА, довести рн до 8.5). 3. Довести до кипения, кипятить до полного растворения агарозы. 4. Остудить до o С (можно держать банку в руках), добавить бромистый этидий до концентрации 0,1 %. 5. Залить форму, дать агарозе застыть в течение часа. 6. В кармашки внести образцы НК, предварительно добавив буфер для электрофореза (0.1% бромфеноловый синий, 0.1% ксиленцианол, 60% глицерин, 60мМ ЭДТА). 7. Нагрузка выбирается из расчета 6 10 В на 1 см геля. 18

19 Комментарии к методике: 1) Использовать гель в течение ~2 часов, либо, не вынимая гребёнку, завернуть в SaranWrap, убрать в холодильник (можно хранить в течение месяца; для < 1% гелей вынимать гребенку из геля можно лишь непосредственно перед применением). 2) При работе с короткими по длине фрагментами ДНК можно использовать ТВЕ буфер (50х: 1М Трис-HCI, 0.9М борной кислоты, 1мМ ЭДТА, довести рн до 8.5), способствующий их лучшему разделению. Раздел 2. Методы анализа нуклеиновых кислот Глава I. Обратная транскрипция Обратная транскрипция перенос информации с РНК на ДНК, процесс, обратный нормальной транскрипции, осуществляемый ферментом обратной транскриптазой. Обратная транскриптаза (ревертаза, РНКзависимая ДНКполимераза) фермент класса трансфераз, осуществляющий ДНК-зависимый синтез ДНК и синтез ДНК на матрице РНК (обратная транскрипция). Кроме того, обратная транскриптаза обладает активностью РНКазы Н (т.е. разрушает цепь РНК, входящую в состав ДНК/РНК-дуплекса). Подобно всем ДНКполимеразам, обратная транскриптаза способна функционировать только при наличии затравки. In vivo обратная транскриптаза синтезирует двухцепочечную ДНК на матрице геномной РНК ретровирусов, подготавливая ее для интеграции в геном клетки-хозяина. Обратная транскриптаза широко используется в генной инженерии для клонирования последовательностей нуклеотидов мрнк эукариот. Впервые обнаружена в В результате работы ревертазы образуется комплементарная ДНК (кднк), образующаяся на основе клеточной матричной РНК (мрнк). Для 19

20 синтеза новой цепи ферменту необходима точка инициации, являющейся началом синтеза новой цепи, строительный материал для синтеза ДНК, которым являются дезоксинуклеотидфосфаты (днтф) и ингибитор рибонуклеаз (RNAsin). Для получения кднк возможно проведение трех вариантов реакции обратной транскрипции. Первый тип предполагает использование в качестве затравки oligo(dt) праймер (набор олигонуклеотидов разной длины в состав которого входит только нуклеотид тимин), при этом в качестве матрицы для синтеза кднк будет использоваться только мрнк, поскольку она имеет на 3 -конце поли-а последовательность, комплементарную oligo(dt) праймеру. Рис. 5. Схема проведения обратной транскрипции с использованием в качестве затравки oligo(dt) праймер 20

21 Второй тип реакции обратной транскрипции основан на применении в качестве затравки случайных праймеров (random hexamer). В данном случае матрицей для синтеза новой кднк будут служить любые типы РНК, поскольку случайные праймеры длиной шесть нуклеотидов будут присоединяться к комплементарному участку любой цепи. Рис. 6. Схема проведения обратной транскрипции с использованием в качестве затравки random hexamer праймер Третий вариант проведения реакции обратной транскрипции подразумевает использование в качестве затравки специфического праймера, который предполагается использовать для последующей реакции ПЦР. В данном варианте проведения опыта матрицей для синтезируемой кднк будет выступать мрнк исследуемого гена. 21

22 Рис. 7. Схема проведения обратной транскрипции с использованием в качестве затравки специфический праймер Работа 8. Методика проведения обратной транскрипции с использованием фермента M-MuLV Reverse Transcriptase 1. Приготовить смесь общим объемом 11 мкл, состоящую из РНК и праймеров: a. РНК: суммарная РНК мкг; мрнк 10 нг 0.5 мкг; специфическая РНК 0.01 пг 0.5 нг. b. праймер: oligo(dt) 0.5 мкг; random hexamer 0.2 мкг; специфический праймер пм. c. довести деионизованной водой до 11 мкл. 22

23 2. Перемешать и инкубировать при 70 о С 5 минут и быстро перенести на лед. 3. Добавить следующие компоненты: a. 10х реакционный буфер 2 мкл, b. 10мМ днтф 2 мкл, c. ингибитор рибонуклеаз 20 ед., d. деионизованной воды до 19 мкл. 4. Инкубировать смесь при 37 о С 5 минут. Если использовались random hexamer, то инкубировать при 25 о С 5 минут. 5. Добавить 200 ед. M-MuLV Reverse Transcriptase, инкубировать реакционную смесь, содержащую oligo(dt) и специфический праймер при о С 60 минут. Если использовались random hexamer, инкубацию проводить при 25 о С 60 минут. 6. Остановить реакцию нагреванием до 70 о С. Охладить на льду. Комментарии к методике: 1) Синтезированная кднк может использоваться непосредственно для амплификации методом ПЦР. Однако можно провести очистку полученной кднк методом фенолхлороформной экстракции и осаждением этанолом, что позволит избавиться от примесей, влияющих на качество ПЦР. Глава II. Полимеразная цепная реакция Суть полимеразной цепной реакции (ПЦР) заключается в амплификации (умножении) в пробирке определенного участка ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов. В основе ПЦР лежит обычная биохимическая реакция синтеза, катализируемая ферментом ДНКполимеразой. 23

24 Открытие ПЦР было обусловлено расшифровкой нуклеотидных последовательностей генома ряда микроорганизмов и обнаружением термоустойчивой Taq-ДНК-полимеразы. Данный фермент находится в живущих в горячих источниках бактериях Thermus aquaticus, обладает исключительной термостойкостью и сохраняет ферментативную активность в течение 40 минут при температуре 95 и имеет оптимум работы при ПЦР это процесс, состоящий из многократно повторяющихся циклов и заканчивающийся получением большого количества копий специфического фрагмента ДНК. Ключевым компонентом реакции, помимо Taq- ДНК-полимеразы, являются короткие (20 30 нуклеотидов) искусственно синтезированные олигонуклеотиды праймеры, комплементарные искомым участкам на левой и правой границах матричной ДНК. Праймеры выполняют ряд важных функций при проведении ПЦР: 1) праймеры являются точкой инициации синтеза новой цепи ДНК, 2) достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними, 3) гибридная двуцепочечная система ДНК-праймер является местом присоединения ДНК-полимеразы к матрице. ПЦР проводят в специальном программируемом термостате амплификаторе, осуществляющем смену температурных циклов по заданной программе. Основным компонентом ДНК-амплификатора является элемент Пэльтье, способный осуществлять быстрые температурные переходы. Каждый цикл ПЦР состоит из 3 этапов. На этапе денатурации при 95 происходит плавление цепочки ДНК и расхождение ее на две цепи. На последующем этапе отжига при наличии в пробе искомого участка ДНК происходит присоединение (отжиг) праймеров (по одному на каждую цепь). Температура присоединения праймеров составляет в зависимости от их нуклеотидного состава При последующем подъеме температуры до 72 активируется Taq-ДНКполимераза и начинается этап синтеза, заключающийся в присоединении дезоксинуклеотидтрифосфатов и достраивании фрагмента ДНК. Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для вто- 24

25 рого цикла амплификации, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК (ампликона). С каждым последующим циклом количество копий участка ДНК удваивается. Таким образом, происходит накопление ампликонов по формуле: х = 2n, где n число циклов. В результате циклов в растворе накапливается около 100 миллионов молекул ампликона. Этого количества достаточно для визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Рис. 8. Схематическое изображение амплификации ДНК: 1 денатурация при 96 о C; 2 отжиг в 68 o C; 3 удлинение в 72 o C; 4 окончание первого цикла. (P Taq-ДНК-полимераза). Две образующихся цепи ДНК являются шаблоном для следующего цикла. Таким образом, происходит удваивание количества ДНК в каждом новом цикле 25

26 Для проведения полимеразной цепной реакции необходимо подготовить смесь, содержащую все необходимые компоненты для построения новой цепи ДНК: 1) нуклеотиды: datp, dgtp, dutp, dctp, являются необходимыми компонентами смеси и субстратами для ДНКполимеразы при построении новой цепи ДНК; 2) кофакторы фермента: поскольку Taq-ДНК-полимераза является Mg-зависимым ферментом, для ее нормального функционирования требуется присутствие этих ионов в реакционной смеси; 3) Taq-ДНК-полимераза: фермент, осуществляющий синтез новой цепи ДНК на основе ДНК-матрицы; 4) буфер: используется для поддержания необходимого значения рн среди и концентрации солей; 5) праймеры: короткие нуклеотидные последовательности ДНК (20 40 нуклеотидов), комплементарные искомому участку ДНК-матрицы; 6) ДНК-матрица: последовательность ДНК, на основе которой ДНК-полимераза синтезирует новую цепь. Работа 9. Методика проведения полимеразной цепной реакции 1. Подготовить все необходимые реагенты для проведения ПЦР. 2. В стерильной пробирке смешать компоненты в следующих соотношениях: 26

27 Компонент Конечная концентрация Количество компонента на 50 мкл смеси 10х ПЦР-буфер 1х 5 мкл 10мМ смесь днтф 0.2 мм каждого 1 мкл Праймер 1 (50 мкм) 1 мкм 1мкл Праймер 2 (50 мкм) 1 мкм 1мкл Taq-ДНК-полимераза 1.25 ед. 0.5 мкл 25мМ MgCI мм 2 5 мкл ДНК-матрица мкг варьирует от концентрации образца Деионизованная вода до 50 мкл 3. Перемешать на вортексе. При необходимости добавить минеральное масло (20 40 мкл) для ПЦР. 4. Поместить образцы в ДНК-амплификатор и запустить программу. Комментарии к методике: 1) Если матрица одноцепочечная или ПЦР-продукт, этап начальной денатурации можно опустить. Кольцевая плазмидная или геномная ДНК требует тепловой денатурации при 95 o C не менее 3 минут. Однако в данном случае не следует злоупотреблять нагреванием, поскольку часть матрицы может повредиться. Для каждого типа ДНКматрицы необходимо подбирать индивидуальное компромиссное решение. 2) Число циклов обычно Слишком большое число циклов чревато насыщением PCR реакции: ограничение по праймерам (синтез длинных продуктов, образованных в результате использования в качестве праймера готового продукта), ограничение по нуклеотидам (большая доля одноцепочечных продуктов, синтез коротких продуктов). 3) Для повышения специфичности ПЦР можно использовать технику так называемого горячего старта, суть которого заключается в добавлении фермента в пробирку с реакционной смесью только после проведения первой денатурации. 4) Для проведения ПЦР часто бывает удобно использовать смеси: a) все, кроме матрицы и Taq-полимеразы. Хранить при 20 o С продолжительное время, при 4 o С несколько суток; b) все, кроме матрицы и праймеров. Хранить при 70 o С и 20 o С продолжительное время, при 4 o С несколько недель. 27

28 c) все, кроме матрицы. Хранить при 70 o С и 20 o С продолжительное время, при 4 o С не более суток. Однократное замораживание-оттаивание не меняет эффективность работы Taq-полимеразы. 5) Если в методике предусмотрено использование масла, то после проведения ПЦР можно избавиться от него следующим способом: заморозить на 20 o С. Вода замёрзнет, масло нет; можно дополнительно сполоснуть охлаждённым (~4 o С) хлороформом. Глава III. Полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-Time PCR) Данные методы основаны на использовании флуорофоров молекул, обладающих способностью к флуоресценции в результате поглощения энергии света определенной длины волны и излучать ее на другой длине волны. Для большинства флуорофоров существуют соединения-гасители, молекулы которых, находясь в непосредственной близости с ними, значительно снижают уровень флуоресценции. Они как бы перехватывают на себя энергию излучения от флуорофора. Различают два основных типа гасителей флуоресцирующие и «темновые». В первом случае переданная гасителю энергия излучается в виде света, отличающегося от свечения свободного от гасителя флуорофора, а во втором рассеивается в виде тепла, т.е. свечение отсутствует. Эффект гашения резко снижается при увеличении расстояния между молекулами флуорофора и гасителя. Основные преимущества детекции продуктов ПЦР заключаются в следующем: в отличие от электрофорезной детекции, полученные в ходе ПЦР ампликоны, не могут попасть в воздух и привести к появлению ложноположительных результатов. Использование специальных флуоресцентных меток позволяет отказаться от стадии электрофореза, что ведет к рез- 28

29 кому уменьшению вероятности контаминации исследуемых проб продуктами амплификации. Кроме того флуоресцентная детекция продуктов ПЦР в пробирке в 2 3 раза чувствительнее электрофорезной детекции. Ниже представлены наиболее распространенные методы детекции продуктов амплификации ДНК-олигонуклеотидных последовательностей. Данные методы можно разделить на 2 основные группы. В первой группе методов, детектирующих ДНК, находятся методы, использующие олигонуклеотиды или зонды, меченые красителем, обладающим способностью к флуоресценции. 1. Метод гидролизуемых проб или Taqman. В данном случае в реакционную смесь добавляют ДНК-зонды, в состав которых входит флуоресцентная метка в 5 -положении и гаситель флуоресценции в 3 -положении, а также фосфатная группа в 3 -положении. Эти зонды имеют места посадки внутри амплифицируемой области. Гаситель поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение, а фосфатная группа в 3 -положении блокирует ДНК-полимеразу. В ходе ПЦР во время стадии отжига праймеров происходит присоединение ДНК-зонда к комплементарной цепи ДНК, причем, чем больше продуктов амплификации образуется в ходе ПЦР, тем больше молекул зондов свяжется с соответствующими ампликонами. Во время стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и при достижении зонда начинает его расщеплять благодаря наличию 5 -экзонуклеазной активности. Таким образом, происходит разъединение флуоресцентной метки и гасителя, что приводит к увеличению детектируемого свечения. Чем больше ампликонов синтезировано в ходе ПЦР на данный момент времени, тем интенсивнее будет свечение. 29

30 Рис. 9. Принцип детекции ПЦР-продуктов с использованием зондов Taqman. Ф флюорофор. Г гаситель 2. Метод с использованием зондов с комплементарными концевыми последовательностями (Molecular Beacons). Данная методика отличается от описанной выше лишь тем, что концевые последовательности зонда представляют собой взаимно комплементарные области из 5 6 оснований, вследствие чего они находятся в замкнутом состоянии и образуют «шпильки». Внутренняя часть зондов содержит нуклеотидную последовательность, комплементарную амплифицируемой области. «Шпилька» зонда в процессе ПЦР денатурирует, и концы зонда (флуоресцентная метка и гаситель) расходятся в разные стороны, и он специфически присоединяется к матрице. Затем под действием 5 -эндонуклеазной активности Taq-полимеразы, достраивающей новую цепь ДНК от праймера, зонд разрезается, флуорофор оказывается свободным от гасителя. В результате увеличивается интенсивность свечения. При отсутствии спе- 30

31 цифического отжига праймеров и зондов, не происходит присоединение их к ДНК-матрице и сохраняется тушение флуоресценции. Рис. 10. Принцип детекции ПЦР-продуктов с использованием зондов Molecular Beacons. Ф флюорофор. Г гаситель 3. Метод с использованием частотного резонансного переноса энергии (Light Cycler). В данном случае используют 2 зонда с резонансным переносом энергии. Данный способ детекции накопления продуктов амплификации отличается повышенной специфичностью, так как увеличение флуоресценции происходит при комплементарном связывании с ампликонами сразу двух ДНК-зондов. Принцип метода заключается в переносе энергии от одного флуорофора, находящегося на 3`-конце первого зонда, ко второму флуорофору, находящемуся на 5`-конце второго зонда, причем расстояние между зондами, содержащими флуоро- 31

32 форы составляет 1 5 нуклеотидов. При одновременном связывании обоих зондов с ДНК-матрицей испускаемое первым флуорофором излучение передается на второй флуорофор, а его излучение детектируется прибором. Таким образом, возрастает специфичность анализа. Рис. 11. Принцип детекции ПЦР-продуктов с использованием метода частотного резонансного переноса энергии (Light Cycler). Фд флюорофор-донор. Фа флюорофор-акцептор Ко второй группе методов детекции продуктов ПЦР принадлежат методы, основанные на использовании интеркалирующих веществ, активирующих свою способность к флуоресценции в результате присоединения к ДНК. В качестве основных представителей этих веществ можно назвать бромистый этидий, красители SYBR Green I/II и SYBR Gold. Этот способ детекции основан на том факте, что флуоресценция бромистого этидия и красителя SYBR Green I и SYBR Gold под действием ультрафиолетового излучения значительно возрастает при их внедрении в двухцепо- 32

33 чечные молекулы ДНК (см. рис. 4). В настоящее время красители SYBR Green I и SYBR Gold признаны более чувствительными по сравнению с бромистым этидием. В настоящее интеркалирующие агенты используются для детекции продуктов ПЦР непосредственно в ходе и по завершению ПЦР. Для этого добавляют краситель SYBR Green I в реакционную ПЦРсмесь перед запуском ПЦР. Однако следует отметить то, что в данном случае увеличение флуоресценции может быть связано как с накоплением специфического, так и неспецифического (праймеры-димеры, шмеры) продукта. В этой связи детекция продуктов ПЦР с помощью предварительного добавления интеркалирующих агентов в ПЦР-смесь требует дополнительного изучения полученных ампликонов с помощью построения так называемых «кривых плавления». Кроме того, в ряде случаев возникает необходимость нормализации сигнала флуоресценции красителя, используемого в реакции, что достигается использованием пассивного референсного красителя, например ROX. Принцип построения «кривых плавления» основан на том, что для конкретной ДНК-последовательности существует своя температура плавления. Если мы будем повышать температуру раствора ДНК, то на какомто уровне средняя кинетическая энергия молекул окажется выше энергии водородных связей, которыми скреплены половинки двойной спирали. Температура, при которой распадается (денатурирует) половина молекул ДНК, называется температурой плавления. В паре гуанин-цитозин (ГЦ) три водородные связи, в паре аденин-тимин (АТ) только две. Поэтому чем больше ГЦ в ДНК, тем более она «тугоплавка». Отсюда следует, что по ширине интервала температур, в котором ДНК плавится, можно судить о ее составе. «Кривые плавления» исследуют после окончания ПЦР, когда реакционную смесь нагревают, и молекула флюорофора отщепляется от ДНК, и ее флуоресценция резко снижается. Если в пробирке находятся ампликоны с разной температурой плавления, то на кривой будет заметно не- 33

34 сколько пиков, каждый из которых будет соответствовать своему ампликону. Наличие ампликонов с разной температурой плавления свидетельствует о накоплении неспецифических продуктов ПЦР. Рис. 12. Исследование полученных ампликонов с помощью «кривых плавления». Tm 1 и Tm 2 температура плавления продуктов реакции. Пунктирная линия интенсивность свечения ПЦР-продуктов, содержащих флуоресцентную метку. Сплошная линия интенсивность свечения референсного красителя Процедура проведения ПЦР в реальном времени имеет некоторые отличия от базовой, связанные с необходимостью детекции продуктов амплификации после каждого цикла. Работа 10. Методика амплификации с использованием красителя SYBR Green 1) Подготовить все необходимые реагенты для проведения ПЦР. 2) В стерильной пробирке смешать компоненты в следующих соотношениях: 34

35 Компонент Конечная концентрация Количество компонента на 50 мкл смеси 10х ПЦР-буфер 1х 5 мкл 10мМ смесь днтф 0.2 мм каждого 1 мкл Праймер 1 (5 мкм) 0.1 мкм 1мкл Праймер 2 (5 мкм) 0.1 мкм 1мкл SYBR Green мкл ROX 0.26 мкл Taq-ДНК-полимераза 1.25 ед. 0.5 мкл 25мМ MgCI 2 5 мм 10 мкл ДНК-матрица мкг варьирует от концентрации образца Деионизованная вода до 50 мкл 3) Перемешать на вортексе. Поместить образцы в ДНК-амплификатор и запустить программу: 1. Первичная денатурация ДНК при 95 о С. Время денатурации зависит от типа используемой матрицы. 2. Денатурация цикла при 95 о С 30 с. 3. Отжиг праймеров при о С с. 4. Элонгация при о С 1 мин. 5. Детекция флюорисцентного сигнала. 6. Повтор цикла амплификации (этапы со 2 по 5) раз. 7. Построение кривых плавления в интервале от 60 о C до Комментарии к методике: 95 о C с детекцией через каждые 0.2 о C. 1) Поскольку краситель SYBR Green довольно быстро разлагается на свету, необходимо все манипуляции совершать быстро и в затемненных пробирках. 2) Для того, чтобы предотвратить образование димеров праймеров, стадия отжига должна быть как можно короче. Как правило, с вполне достаточно для отжига праймеров на специфическом субстрате. 3) Поскольку SYBR Green, как правило, дает достоверные результаты при C(T) не больше 35 38, 40 циклов амплификации является оптимальным значением. 4) При работе с SYBR Green необходимо строить кривую плавления ДНК для определения специфичности ПЦР-реакции. 35

36 Работа 11. Методика амплификации ДНК с применением зондов Taqman 1) Подготовить все необходимые реагенты для проведения ПЦР. 2) В стерильной пробирке смешать компоненты в следующих соотношениях: Компонент Конечная концентрация Количество компонента на 50 мкл смеси 10х ПЦР-буфер 1х 5 мкл 10мМ смесь днтф 0.2 мм каждого 1 мкл Праймер 1 (5 мкм) 0.1 мкм 1мкл Праймер 2 (5 мкм) 0.1 мкм 1мкл TaqMan 0.25 мкм 1 мкл Taq-ДНК-полимераза 1.25 ед. 0.5 мкл 25мМ MgCI мм 7 мкл ДНК-матрица мкг варьирует от концентрации образца Деионизованная вода до 50 мкл 3) Перемешать на вортексе. Поместить образцы в ДНК-амплификатор и запустить программу: 1. Первичная денатурация ДНК при 95 о С 10 мин. 2. Денатурация цикла при 95 о С 15 с. 3. Отжиг праймеров с последующей элонгацией цепи при 60 о С 1 мин. 4. Детекция флюорисцентного сигнала. 5. Повтор цикла амплификации (этапы со 2 по 4) раз. Комментарии к методике: 1) Поскольку при проведении такого типа реакции ПЦР-РВ используются специфические типы полимераз (Pfu, Pwo и др.), их активность проявляется в диапазоне температур о С. 2) Построение кривой плавления после реакции не обязательно (это будет кривая плавления не ПЦР-продуктов, а дуплекса зонда с ампликоном). 36

37 Работа 12. Обработка данных Детекция в реальном времени флюоресценции продуктов ПЦР позволяет вычислять первоначальное количество присутствия шаблона в различных образцах. Осуществляется это путем подсчета числа циклов ПЦР, необходимых для достижения заданного уровня флюоресценции (пороговой флюоресценции). В связи с тем, что интенсивность флюоресценции отражает количество продукта, то для образцов, которые первоначально имели больше матрицы, потребуются меньше циклов ПЦР для достижения заданного порога флюорисценции, чем для образцов с меньшим количеством матрицы. Такая взаимосвязь может быть задана математически: количество циклов, необходимых для достижения порога (то есть пороговый цикл, или величина C T ), обратно пропорционально логарифму первоначального количества матрицы. Поэтому значения C T могут использоваться для расчета исходного количества матрицы. Для подсчета исходного количества матрицы в образце необходимо сначала задать порог флюоресценции, при котором различные образцы будут сравниваться. Для этого сначала необходимо начертить зависимость флюоресценции от номера цикла, а затем провести линию порога на графике в точке, где сигналы превосходят фоновые уровни и начинают увеличиваться экспоненциально. Величина C T для отдельного образца определяется, как цикл, при котором линия флюоресценции образца пересекла линию порога. Значения C T, полученные в разных образцах, сравниваются с C T стандарта для вычисления абсолютного или относительного количества шаблона. Если величины количественного анализа образцов совпадают с диапазоном матрицы, то можно сгенерировать линейную стандартную кривую зависимости логарифма количества матрицы от C T. Абсолютное количество исходной матрицы в неизвестных образцах затем может быть 37

38 рассчитано из стандартов, используя значения C T образцов. Если способ расчета по стандартам невозможен, то количество шаблона в одном образце может быть вычислено относительно другого образца на основании разницы в значениях C T ΔC T. В настоящее время разработано большое количество программного обеспечения, которое автоматически генерирует стандартные кривые для абсолютного количественного анализа, если стандарты заданы в настройке плашки. Кроме того, программное обеспечение также оценивает эффективность реакции и вычисляет значения ΔC T для анализа относительных значений. Два основных принципа обработки данных ПЦР в реальном времени: 1. Метод калибровочного графика. 2. Прямое сравнение данных. Метод калибровочного графика Этот метод предполагает построение калибровочного графика в координатах C(T) log P 0 с серией разведений ДНК-стандарта, из которого находят концентрацию субстрата (P 0 ) в экспериментальных образцах. Точность метода зависит от того, насколько условия ПЦР (и, прежде всего, эффективность амплификации) серии стандартов близки к условиям ПЦР экспериментальных образцов. Поэтому при выборе стандартов необходимо руководствоваться следующими правилами: 1. Содержание примесей в стандартном препарате должно быть сходно с таковым в экспериментальном препарате. 2. Доля амплифицируемого фрагмента в стандартной ДНК должна быть близка к таковой в экспериментальной ДНК. 3. Серия разведений стандартной ДНК должна охватывать весь диапазон возможных концентраций субстрата в экспериментальной ДНК. 38

39 Если достаточно определить лишь относительную концентрацию субстрата, для построения калибровочного графика удобно использовать серию разведений одного из экспериментальных образцов. В тех случаях, когда образцы могут сильно отличаться по примесям и доле амплифицируемого фрагмента в реакционной смеси, имеет смысл при наладке эксперимента приготовить серию разведений каждого из них и сравнить эффективности. Прямое сравнение данных Из уравнения C(T) = (1/log E) * log P 0 + log P C(T) /log E (1) следует, что при равной эффективности реакции E в образцах 1 и 2, относительная концентрация субстрата R = P1/P2 = E (C(T) 1 C(T) 2 ) = E - С(T) (2) Проведем нормализацию этих результатов по данным амплификации с контрольной последовательностью REF (соответствующей, например, housekeeping gene (конститутивный, референсный ген)). Пусть реакция REF в обоих образцах протекает с эффективностью E ref. Тогда R = E С(T) / E С(T) ref ref. (3) Если эффективности «контрольной» и «опытной» реакций сходны, приближенно можно записать: R = E С(T) / E С(T) ref = E С(T) ref С(T. ) (4) И, наконец, если обе реакции протекают со сходной эффективностью, близкой к 2, формула упрощается до вида: R= E С(T) ref - С(T) ~ 2 С(T) ref - С(T) = 2 - С(T. ) (5) 39

40 При проведении ПЦР-РВ в качестве REF можно использовать последовательность, соответствующую референсному гену, однако нужно иметь в виду, что уровень экспрессии некоторых референсных генов иногда значительно варьирует в разных тканях. Лучше всего проводить нормализацию по усредненным данным амплификации нескольких house-keeping genes. Рис. 13. Расчет данных ПЦР-РВ методом прямого сравнения (ΔΔС Т метод) 40

41 Глава IV. Гибридизация нуклеиновых кислот В 1961 году было обнаружено, что процесс денатурации ДНК обратим: после денатурации при 100 о С, выдерживание ДНК при температуре 65 о С привело к восстановлению структуры двойной спирали. Этот процесс называется ренатурация или гибридизация. Процессы гибридизации происходят между любыми одинарными цепями, если они комплементарны: ДНК ДНК, РНК РНК, ДНК РНК. Для проведения гибридизации необходимо иметь чистый одноцепочечный фрагмент ДНК, комплементарный той последовательности, которую необходимо обнаружить. Этот фрагмент получают либо клонированием, либо путем химического синтеза. Одноцепочечная ДНК, используемая в качестве индикатора, называется ДНК-зонд. Она может содержать от 15 до 1000 нуклеотидов. Анализ проводят по следующей схеме: исследуемую ДНК гидролизуют рестриктазами, фракционируют электрофорезом, переносят разделенные фрагменты на нитроцеллюлозный фильтр и проводят реакцию гибридизации с мечеными олигонуклеотидами. Зонд метится какой-либо репортерной группой: радиоактивным изотопом, флуорохромом, ферментом, дающим окрашенный или люминесцирующий продукт и т. д. Этот метод был разработан Саузерном в 1975 году. «Блоттинг» в переводе с английского означает «промокашка», «саузерн» «южный». Молекулы исследуемой ДНК разгоняют в агарозном геле электрофорезом. ДНК в геле денатурируют щелочью. После переноса щелочь нейтрализуют, и пластину геля накрывают нитроцеллюлозой. Сверху на нитроцеллюлозу помещают стопку листов фильтровальной бумаги, обеспечивая медленный ток буферного раствора через гель в направлении, перпендикулярном направлению электрофореза. ДНК диффундирует из геля и 41

42 связывается с нитроцеллюлозным фильтром. Данный способ переноса ДНК на нитроцеллюлозную мембрану получил название «мокрый перенос». После прогревания фильтра при 80 о С в вакууме или обработки УФсветом ДНК необратимо связывается с нитроцеллюлозой. Затем мембрану помещают в раствор с меченым зондом, в котором и происходит гибридизация. После отмывки несвязавшейся радиоактивности результат выявляют с помощью радиоавтографии или иных способов в случае использования нерадиоактивных меток. Расположение полос иммобилизованной ДНК точно соответствует их расположению в геле. Рис. 14. Схема проведения гибридизации ДНК по Саузерну 42

43 ДНК, связанную с нитроцеллюлозным фильтром, можно гибридизовать с радиоактивно меченым ДНК-зондом. Блоттинг по Саузерну является исключительно полезным также и для локализации изучаемых генов в определенных фрагментах, полученных в результате гидролиза различными рестриктазами гибридных молекул ДНК, хромосомной ДНК и т. д. Аналогичным методом на нитроцеллюлозу переносят молекулы РНК (Нозерн (северный) блоттинг) и белка (Вестерн (западный) блоттинг). При проведении гибридизации РНК по Нозерну, стандартные условия блотинга по Саузерну не применимы, так как она не связывается с обычными нитроцеллюлозными и нейлоновыми мембранами. Для иммобилизации РНК вначале был предложен специальный вид бумаги с диазобензилоксиметилом (DMB-целлюлоза), а затем были найдены условия для нековалентного связывания РНК с нитроцеллюлозой (предварительная денатурация РНК диметилсульфоксидом, формальдегидом и др.) и разработаны для этого подходящие нейлоновые фильтры. Одним из наиболее точных и современных методов анализа является использование чипов. Они представляют собой пластинки с иммобилизованными меченными ДНК-зондами. Каждая такая пластинка может содержать несколько десятков тысяч зондов, расположенных в определенной последовательности. Метка проявляется только в спаренных двухцепочечных фрагментах. Если в исследуемом образце есть последовательности, комплементарные последовательностям зонда, то гибридизацию можно определить визуально или с помощью специальных приборов. Как правило, детекторы соединены с компьютером, то есть процедура считывания и обработки информации автоматизирована. При подготовке ДНК-зондов включение метки в ДНК возможно двумя основными способами: 1) Удлинение затравки. Данный способ получения ДНК-зондов подразумевает использование олигонуклеотида (менее 20 звеньев), ком- 43

Encyclo Plus PCR kit

Encyclo Plus PCR kit Encyclo Plus PCR kit Набор реактивов Номер по каталогу PK101 Инструкция по применению Набор реактивов Encyclo Plus PCR kit предназначен только для исследовательских работ, выполняемых профессионально подготовленными

Подробнее

Рекомендации по постановке ПЦР

Рекомендации по постановке ПЦР Рекомендации по постановке ПЦР К наборам реактивов ## PK101, PK121. К полимеразам ## PK002S/L, PK013, PK014, PK015, PK016, PK022, PK123S/L. К готовым смесям для ПЦР ## PK041S/L, PK143S/L, PK145S/L, PK147S/L,

Подробнее

Глава 11 Методы анализа генов

Глава 11 Методы анализа генов Глава 11 Методы анализа генов 1. CS Ферменты рестрикции: a) используются в ПЦР; b) узнают одноцепочечную ДНК; c) узнают и разрезают специфические двуцепочечные последовательности ДНК; d) встречаются у

Подробнее

ПЦР в реальном времени

ПЦР в реальном времени ПЦР в реальном времени Одним из самых современных вариантов ПЦР является ПЦР в реальном времени(3). Название отражает общий смысл новой модификации. ПЦР в реальном времени основана на количественной детекции

Подробнее

Набор реактивов MMLV RT kit

Набор реактивов MMLV RT kit Набор реактивов MMLV RT kit Номер по каталогу SK021 Инструкция по применению Набор реактивов MMLV RT kit предназначен только для исследовательских работ, выполняемых профессионально подготовленными пользователями.

Подробнее

Номера по каталогу BC35T, BC35S, BC35M, BC35L

Номера по каталогу BC35T, BC35S, BC35M, BC35L КлинМаг ДНК Набор реактивов Номера по каталогу BC35T, BC35S, BC35M, BC35L Набор для очистки ДНК на магнитных частицах Инструкция по применению Набор реактивов КлинМаг ДНК предназначен только для исследовательских

Подробнее

Гибридизация нуклеиновых кислот

Гибридизация нуклеиновых кислот Гибридизация нуклеиновых кислот Гибридизация нуклеиновых кислот T m температура плавления Методы, основанные на гибридизации нуклеиновых кислот Хорошо охарактеризованная ДНК или олигонуклеотидные фрагменты

Подробнее

FBio-Tri-Реагент для выделения РНК из биологического материала

FBio-Tri-Реагент для выделения РНК из биологического материала FBio-Tri-Реагент для выделения РНК из биологического материала Содержание Описание... 3 Ограничения на использование продукта... 3 Гарантия... 3 Техника безопасности... 4 Принцип действия... 4 Необходимое

Подробнее

ИНСТРУКЦИЯ VIBRIO СHOLERAE

ИНСТРУКЦИЯ VIBRIO СHOLERAE ИНСТРУКЦИЯ по применению комплекта реагентов для проведения ПЦРамплификации ДНК токсигенных штаммов холерного вибриона VIBRIO СHOLERAE ВНИМАНИЕ! Vibrio cholerae относится ко II группе патогенности. Все

Подробнее

ИНСТРУКЦИЯ ВИЧ-ГЕН. Регистрационное удостоверение МЗ СР РФ ФСР 2008/ ВНИМАНИЕ! Изучите инструкцию перед началом работы

ИНСТРУКЦИЯ ВИЧ-ГЕН. Регистрационное удостоверение МЗ СР РФ ФСР 2008/ ВНИМАНИЕ! Изучите инструкцию перед началом работы ИНСТРУКЦИЯ по применению набора реагентов для выявления нуклеиновых кислот (НК) вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) ВИЧ-ГЕН Регистрационное

Подробнее

Пробоподготовка. Методы выделения ДНК/РНК. Кулмамабетова Г

Пробоподготовка. Методы выделения ДНК/РНК. Кулмамабетова Г Пробоподготовка. Методы выделения ДНК/РНК. Кулмамабетова Г ДНК может быть выделена из любого образца Кровь Сперма Слюна Моча Волос Зубы Кость Ткань Букальные клетки содержащего клетки Сигаретный окурок

Подробнее

Набор для определения мутации L138 в гене CFTR

Набор для определения мутации L138 в гене CFTR Набор для определения мутации L138 в гене CFTR Содержание Компоненты набора... 3 Область применения... 3 Гарантия... 3 Описание... 4 Необходимое оборудование... 4 Важные замечания... 5 Меры предосторожности...

Подробнее

ИНСТРУКЦИЯ. по применению наборов реагентов для амплификации кднк вирусов, поражающих картофель, методом полимеразной цепной реакции.

ИНСТРУКЦИЯ. по применению наборов реагентов для амплификации кднк вирусов, поражающих картофель, методом полимеразной цепной реакции. ИНСТРУКЦИЯ по применению наборов реагентов для амплификации кднк вирусов, поражающих картофель, методом полимеразной цепной реакции. вирус скручивания листьев картофеля, вирус метельчатости верхушки картофеля,

Подробнее

Набор для выявления вирусов инфекционного ларинготрахеита и болезни Марека

Набор для выявления вирусов инфекционного ларинготрахеита и болезни Марека Набор для выявления вирусов инфекционного ларинготрахеита и болезни Марека (количественный) Вир-10-100, на 100 реакций 1 Содержание Компоненты набора... 3 Область применения... 3 Гарантия... 3 Описание...

Подробнее

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ УТВЕРЖДАЮ Первый заместитель министра Р.А. Часнойть 10 апреля 2009 г. Регистрационный 009-0209 ОЦЕНКА АКТИВНОСТИ СИСТЕМЫ ИНТЕРФЕРОНОВ ПО ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ

Подробнее

Иммобилизация антител (белка) на магнитных частицах

Иммобилизация антител (белка) на магнитных частицах Иммобилизация антител (белка) на магнитных частицах Предлагаемая методика дает возможность осуществить ковалентную иммобилизацию антител или белка по Вашему выбору на поверхности магнитных частиц с силикатной

Подробнее

ExtractRNA. Реагент для выделения суммарной РНК из биологических образцов. Номер по каталогу BC032. Инструкция по применению

ExtractRNA. Реагент для выделения суммарной РНК из биологических образцов. Номер по каталогу BC032. Инструкция по применению ExtractRNA Реагент для выделения суммарной РНК из биологических образцов Номер по каталогу BC032 Инструкция по применению Реагент ExtractRNA предназначен только для исследовательских работ, выполняемых

Подробнее

Молекулярная диагностика возбудителей заболеваний картофеля

Молекулярная диагностика возбудителей заболеваний картофеля Молекулярная диагностика возбудителей заболеваний картофеля Владимир Карандашов, к.б.н. Руководитель лаборатории диагностики фитопатогенов ООО «Исследовательский центр «ФитоИнженерия» Московская область,

Подробнее

Готовые решения для лабораторной диагностики молекулярными методами. Каширина Мария Молекулярный биолог ЗАО «БиоХимМак»

Готовые решения для лабораторной диагностики молекулярными методами. Каширина Мария Молекулярный биолог ЗАО «БиоХимМак» Готовые решения для лабораторной диагностики молекулярными методами Каширина Мария Молекулярный биолог ЗАО «БиоХимМак» Исследование фрагментов нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) Основные этапы: В клетке

Подробнее

Методы исследования нуклеиновых кислот. I. Гибридизация

Методы исследования нуклеиновых кислот. I. Гибридизация Методы исследования нуклеиновых кислот I. Гибридизация Что можно исследовать? Первичная последовательность НК Одна из фундаментальных задач молекулярной биологии и биохимии Определенные мутации Пренатальная

Подробнее

«Автоматизация процесса пробоподготовки в ПЦР анализе»

«Автоматизация процесса пробоподготовки в ПЦР анализе» «Автоматизация процесса пробоподготовки в ПЦР анализе» Яцун Екатерина «Актуальные проблемы современной лабораторной диагностики» г. Барнаул, июнь 2010 г. Полимеразная цепная реакция (ПЦР): общие принципы

Подробнее

Encyclo PCR kit. Набор реактивов. Номер по каталогу PK001. Инструкция по применению

Encyclo PCR kit. Набор реактивов. Номер по каталогу PK001. Инструкция по применению Encyclo PCR kit Набор реактивов Номер по каталогу PK001 Инструкция по применению Набор реактивов Encyclo PCR kit предназначен только для исследовательских работ, выполняемых профессионально подготовленными

Подробнее

ИНСТРУКЦИЯ «РЕВЕРТАЗА»

ИНСТРУКЦИЯ «РЕВЕРТАЗА» ИНСТРУКЦИЯ по применению комплекта реагентов «РЕВЕРТАЗА» АмплиСенс ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Российская Федерация, 111123, город Москва, улица Новогиреевская, дом 3а Только для исследовательских

Подробнее

Экзаменационный билет 2. Проф. Левашов Андрей Вадимович Проф. Копылов Алексей Михайлович К.х.н. Федорчук Владимир Витальевич

Экзаменационный билет 2. Проф. Левашов Андрей Вадимович Проф. Копылов Алексей Михайлович К.х.н. Федорчук Владимир Витальевич Экзаменационный билет 1. 1. Функции, структура и свойства биологических мембран. 2. Стационарная кинетика ферментативных реакций. Схема Михаэлиса-Ментен. Методы определения параметров из экспериментальных

Подробнее

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ УТВЕРЖДАЮ Первый заместитель министра Д.Л. Пиневич 11.12.2015 Регистрационный 154-1115 МЕТОД ОЦЕНКИ РИСКА РАЗВИТИЯ ГАСТРИТА инструкция по применению УЧРЕЖДЕНИЕ-РАЗРАБОТЧИК:

Подробнее

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ. МЕТОД ОЦЕНКИ РИСКА РАЗВИТИЯ ГАСТРИТА (инструкция по применению)

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ. МЕТОД ОЦЕНКИ РИСКА РАЗВИТИЯ ГАСТРИТА (инструкция по применению) МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ МЕТОД ОЦЕНКИ РИСКА РАЗВИТИЯ ГАСТРИТА (инструкция по применению) УЧРЕЖДЕНИЕ-РАЗРАБОТЧИК: Государственное учреждение «Республиканский научно-практический

Подробнее

ИНСТРУКЦИЯ. «АмплиСенс GSTT1 / GSTM1-EPh»

ИНСТРУКЦИЯ. «АмплиСенс GSTT1 / GSTM1-EPh» ИНСТРУКЦИЯ по применению набора реагентов для выявления генетических полиморфизмов в генах GSTT1 и GSTM1 человека методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации

Подробнее

ИНФОРМАЦИОННО-ИЗДАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР ГОСКОМСАНЭПИДНАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ИНФОРМАЦИОННО-ИЗДАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР ГОСКОМСАНЭПИДНАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ИНФОРМАЦИОННО-ИЗДАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР ГОСКОМСАНЭПИДНАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ИЗМЕРЕНИЮ КОНЦЕНТРАЦИИ ВРЕДНЫХ ВЕЩЕСТВ В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ Выпуск 28 Москва 1993 37 Цроведение измерения

Подробнее

ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ Аминокапроновая кислота ФС.2.1.0001.15 Аминокапроновая кислота Acidum aminocaproicum Взамен ВФС 42-2720-96 6-Аминогексановая кислота

Подробнее

Инструкция по выполнению методик по научному направлению «Биохимические исследования»

Инструкция по выполнению методик по научному направлению «Биохимические исследования» Инструкция по выполнению методик по научному направлению «Биохимические исследования» Разработала научный консультант НИЦ, к.х.н. Е.Л.Алексахина, ответственная за выполнение данного блока методик 1 Метод

Подробнее

5 баллов, вы получаете от ассистентов (LA) за точное выполнение указаний по технике

5 баллов, вы получаете от ассистентов (LA) за точное выполнение указаний по технике III лаборатория Номер рабочего места: Продолжительность работы 60 минут; 40 баллов Задание: Разделение фрагментов ДНК плазмиды px, полученных в агарозном гель-электрофорезе и построениерестрикционной карты

Подробнее

Методы исследования нуклеиновых кислот

Методы исследования нуклеиновых кислот Методы исследования нуклеиновых кислот Что можно исследовать? Первичная последовательность НК Одна из фундаментальных задач молекулярной биологии и биохимии Определенные мутации Пренатальная диагностика

Подробнее

РУКОВОДСТВО ПО ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА РЕАГЕНТОВ

РУКОВОДСТВО ПО ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ООО БИОЧИП-ИМБ ТРОМБО-БИОЧИП РУКОВОДСТВО ПО ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И ДИАГНОСТИКИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К РАЗВИТИЮ НАРУШЕНИЙ СИСТЕМЫ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ МЕТОДОМ ГИБРИДИЗАЦИИ

Подробнее

Лабораторный протокол для выделения ДНК из 0,5 мл образца

Лабораторный протокол для выделения ДНК из 0,5 мл образца Лабораторный протокол для выделения ДНК из 0,5 мл образца Для выделения геномной ДНК из серий наборов для сбора ДНК Oragene и ORAcollect. Для выбора дополнительных языков и протоколов зайдите на нашу страничку

Подробнее

Генетическая инженерия

Генетическая инженерия *Генная Инженерия Генетическая инженерия Генетическая инженерия (генная инженерия) совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток),

Подробнее

Обработка клинического материала и выделение нуклеиновых кислот

Обработка клинического материала и выделение нуклеиновых кислот Обработка клинического материала и выделение нуклеиновых кислот первый и важнейший этап молекулярно-биологического исследования. Основной задачей данного этапа является получение очищенного препарата ДНК

Подробнее

TIANamp FFPE DNA Kit. Инструкция к набору для выделения геномной ДНК из ткани фиксированной формалином или залитой в парафиновый блок

TIANamp FFPE DNA Kit. Инструкция к набору для выделения геномной ДНК из ткани фиксированной формалином или залитой в парафиновый блок TIANamp FFPE DNA Kit Инструкция к набору для выделения геномной ДНК из ткани фиксированной формалином или залитой в парафиновый блок TIANamp FFPE DNA Kit Состав набора DP331-02 (50 выделений): Буфер GA

Подробнее

ООО АЛЬФАЛАБ. Рабочая инструкция

ООО АЛЬФАЛАБ. Рабочая инструкция ООО АЛЬФАЛАБ Рабочая инструкция по применению набора реагентов для обнаружения ДНК возбудителей гельминтозов (Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis, Opisthorchis felineus, Taenia solium, Diphyllobothrium

Подробнее

ПРОЦЕССИНГ ДНК И РНК 1. Репликация (от ДНК к ДНК) 2. Транскрипция (от ДНК к РНК)( 3. Трансляция (от РНК к белку) 4. Обратная транскрипция

ПРОЦЕССИНГ ДНК И РНК 1. Репликация (от ДНК к ДНК) 2. Транскрипция (от ДНК к РНК)( 3. Трансляция (от РНК к белку) 4. Обратная транскрипция ПРОЦЕССИНГ ДНК И РНК При жизни организма непрерывно происходят процессы обновления тканей, клеток и т.д., которые неизбежно включают процессы копирования и передачи информации, хранящейся в геноме. Направления

Подробнее

ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Натриевая соль N-никотиноил гамма-аминомасляной кислоты Натриевая соль N-никотиноил гамма-аминомасляной кислоты ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ ФС.2.1.0027.15 Natrii

Подробнее

Методические рекомендации для самостоятельной работы обучающихся по дисциплине. Сельскохозяйственная биотехнология

Методические рекомендации для самостоятельной работы обучающихся по дисциплине. Сельскохозяйственная биотехнология ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ОРЕНБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» Методические рекомендации для самостоятельной

Подробнее

Оглавление. Предисловие редакторов перевода...5 Предисловие редакторов шестого издания...7 Авторы...9 Принятые сокращения... 11

Оглавление. Предисловие редакторов перевода...5 Предисловие редакторов шестого издания...7 Авторы...9 Принятые сокращения... 11 Предисловие редакторов перевода...5 Предисловие редакторов шестого издания...7 Авторы...9 Принятые сокращения... 11 Глава 1. Теоретические основы биохимического анализа...13 (разд. 1.7 в соавторстве с

Подробнее

ИНСТРУКЦИЯ.

ИНСТРУКЦИЯ. ИНСТРУКЦИЯ по применению набора реагентов для идентификации гена (RHD) плода в крови матери «ДНК-резус ребенка» и «ДНК-резус ребенка плюс» (варианты на 50 и 100 определений) ТУ 9398-001-64943561-2010 www.testgen.ru

Подробнее

Методы часть 2. Смирнов Арсений Михайлович

Методы часть 2. Смирнов Арсений Михайлович Методы часть 2 Смирнов Арсений Михайлович ДНК наиболее «освоенная» биологическая макромолекула Основные вехи в развитии методов работы с ДНК 1869 Мишер выделяет ДНК из белых клеток крови 1944 Эвери доказывает,

Подробнее

«Использования технологий TECAN в автоматизации NAT-тестирования. Яцун Екатерина г. Ростов-на-Дону, октября 2010 г.

«Использования технологий TECAN в автоматизации NAT-тестирования. Яцун Екатерина г. Ростов-на-Дону, октября 2010 г. «Использования технологий TECAN в автоматизации NAT-тестирования Яцун Екатерина г. Ростов-на-Дону, 13-14 октября 2010 г. Актуальность В Европе с 1999 года ПЦР обязательный метод для тестирования всей донорской

Подробнее

2. Измерение массовой концентрации общего железа с сульфосалициловой кислотой

2. Измерение массовой концентрации общего железа с сульфосалициловой кислотой Государственный стандарт Союза ССР ГОСТ 4011-72 "Вода питьевая. Методы измерения массовой концентрации общего железа" (введен в действие постановлением Госстандарта СССР от 9 октября 1972 г. N 1855) Drinking

Подробнее

ДАГАЗ РЕАГЕНТЫ ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

ДАГАЗ РЕАГЕНТЫ ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ Контактная информация: +7(926) 566-85-14 Адрес: ООО Дагаз 129336, Россия, г Москва, Анадырский Проезд, 63, 263 Время работы: Пн Пт, с 900 до 1800 E-mail: info@dagazsu Как заказать: По e-mail: присылайте

Подробнее

Выделение и очистка белка

Выделение и очистка белка КАЗАНСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОЛОГИИ Кафедра биохимии и биотехнологии Р.Х. АЮПОВ, М.М. ЮСУПОВ Выделение и очистка белка Учебно-методическое пособие Казань 2015

Подробнее

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ Определение белка ОФС.1.2.3.0012.15 Взамен ст. ГФ XII, ч.1, ОФС 42-0053-07 Определение содержания белка проводят в лекарственных

Подробнее

Фотометрический метод определения нитратов и нитритов в биологических жидкостях (инструкция по применению)

Фотометрический метод определения нитратов и нитритов в биологических жидкостях (инструкция по применению) МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ УТВЕРЖДАЮ Первый заместитель министра здравоохранения 19 марта 2001 г. Регистрационный No 91-0008 В.И. Ореховский Фотометрический метод определения нитратов

Подробнее

РЕАГЕНТЫ ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

РЕАГЕНТЫ ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ РЕАГЕНТЫ ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ 2016 Контактная информация: ПРАЙМТЕХ Адрес: ОДО Праймтех Ул. Сурганова, 13, офис 215 220072 Минск БЕЛАРУСЬ Время работы: Пн Пт, с 9:00 до 18:00 E-mail: Как заказать:

Подробнее

Ключевые методы молекулярной биологии. Секвенирование по Сенгеру. Докладчик: Шадрин Д.М.

Ключевые методы молекулярной биологии. Секвенирование по Сенгеру. Докладчик: Шадрин Д.М. Ключевые методы молекулярной биологии. Секвенирование по Сенгеру Докладчик: Шадрин Д.М. 1 История разработки метода Фридрих Мишер Николай Открытие ДНК Константинович 1869 год. Кольцов Структура ДНК, 1927

Подробнее

КЛЕТОЧНЫЕ ЯДРА И ПЛАСТИДЫ РАСТЕНИЙ: биохимия и биотехнология

КЛЕТОЧНЫЕ ЯДРА И ПЛАСТИДЫ РАСТЕНИЙ: биохимия и биотехнология НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ЦЕНТРАЛЬНЫЙ БОТАНИЧЕСКИЙ САД ОТДЕЛ БИОХИМИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ РАСТЕНИЙ КЛЕТОЧНЫЕ ЯДРА И ПЛАСТИДЫ РАСТЕНИЙ: биохимия и биотехнология Сборник материалов Международной конференции,

Подробнее

Ключевые слова: нуклеозиды, нуклеотиды, нуклеиновые кислоты, модифицированные нуклеозидтрифосфаты, аптамеры, органический синтез.

Ключевые слова: нуклеозиды, нуклеотиды, нуклеиновые кислоты, модифицированные нуклеозидтрифосфаты, аптамеры, органический синтез. Аннотация проекта (ПНИЭР), выполняемого в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 2020 годы» Номер Соглашения о предоставлении

Подробнее

анализа (AQ) Глава 1 Краткое описание Введение и пример выполнения абсолютного количественного анализа (AQ) См. стр. 2 Описание прибора 7300/7500

анализа (AQ) Глава 1 Краткое описание Введение и пример выполнения абсолютного количественного анализа (AQ) См. стр. 2 Описание прибора 7300/7500 Глава 1 Введение и пример выполнения абсолютного количественного анализа (AQ) Краткое описание Введение и пример выполнения абсолютного количественного анализа (AQ) Описание прибора 7300/7500 См. стр.

Подробнее

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ. Институт фундаментальной медицины и биологии. Кафедра генетики

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ. Институт фундаментальной медицины и биологии. Кафедра генетики МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» Институт фундаментальной медицины и биологии Кафедра генетики ПРАКТИКУМ ПО МОЛЕКУЛЯРНОЙ

Подробнее

ДНК-макроматрицы и транскрипционное профилирование

ДНК-макроматрицы и транскрипционное профилирование БИОНАНОТЕХНОЛОГИИ Ю.Копа, К.Момыналиев ДНК-макроматрицы и транскрипционное профилирование Современные ДНК-матрицы являются высокочувствительным и точным аналитическим инструментом для научного исследования

Подробнее

Лекция 7. Нуклеиновые кислоты Структура ДНК Синтез ДНК Мутации Структура РНК

Лекция 7. Нуклеиновые кислоты Структура ДНК Синтез ДНК Мутации Структура РНК Лекция 7 Нуклеиновые кислоты Структура ДНК Синтез ДНК Мутации Структура РНК Нуклеиновые кислоты ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) ирнк (рибонуклеиновая кислота) линейные полимеры, мономерами которых

Подробнее

1. Ковалентные связи в белках и ферментах. Приведите примеры.

1. Ковалентные связи в белках и ферментах. Приведите примеры. 1. Ковалентные связи в белках и ферментах. Приведите примеры. БИЛЕТ 1 2. На чем основано разделение белков фракционированием в присутствии разных концентраций солей. От каких примесей этот метод позволяет

Подробнее

ISOLATE II Genomic DNA Kit Набор для выделения геномной ДНК

ISOLATE II Genomic DNA Kit Набор для выделения геномной ДНК ISOLATE II Genomic DNA Kit Набор для выделения геномной ДНК ISOLATE II Genomic DNA Kit предназнчен для быстрого и эффективного выделения образцов геномной ДНК высокой чистоты из различных первичных материалов.

Подробнее

Методические рекомендации МР 02.028-08. Издание официальное

Методические рекомендации МР 02.028-08. Издание официальное ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА ЛАБОРАТОРНЫЙ СОВЕТ ФЕДЕРАЛЬНОЙ СЛУЖБЫ ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА Качественное

Подробнее

Ответы на вопросы и упражнения из тетради для лабораторных и практических работ И. И. Акимовой, Н. В. Запорожец «Химия» ТЕМА «ОРГАНИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ»

Ответы на вопросы и упражнения из тетради для лабораторных и практических работ И. И. Акимовой, Н. В. Запорожец «Химия» ТЕМА «ОРГАНИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ» Ответы на вопросы и упражнения из тетради для лабораторных и практических работ И. И. Акимовой, Н. В. Запорожец «Химия» ТЕМА «ОРГАНИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ» Лабораторная работа 1 Опыты с глицерином: растворимость

Подробнее

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ Испытания на чистоту и ОФС.1.2.2.2.0011.15 допустимые пределы примесей. Взамен ГФ XII, ч. 1, Железо ОФС 42-0058-07 Испытания

Подробнее

ррнк Рибосомальная РНК входит в состав рибосом, сложных надмолекулярных структур, которые состоят из четырех типов ррнк и нескольких десятков белков.

ррнк Рибосомальная РНК входит в состав рибосом, сложных надмолекулярных структур, которые состоят из четырех типов ррнк и нескольких десятков белков. ррнк Рибосомальная РНК входит в состав рибосом, сложных надмолекулярных структур, которые состоят из четырех типов ррнк и нескольких десятков белков. Рибосомальная РНК составляет большую долю (до 80%)

Подробнее

Пекин июль Практический тест. Часть IV

Пекин июль Практический тест. Часть IV СТРАНА: УЧАСТНИК: 16-я Международная Биологическая Олимпиада Пекин июль 2005 Практический тест Часть IV Общее предоставляемое время: 90 минут Загружено с сайта http://bioturnir.ru 43 16-я МБО - Практический

Подробнее

СИНТЕЗ КОЛЛОИДНЫХ РАСВОРОВ НАНОСЕРЕБРА

СИНТЕЗ КОЛЛОИДНЫХ РАСВОРОВ НАНОСЕРЕБРА СИНТЕЗ КОЛЛОИДНЫХ РАСВОРОВ НАНОСЕРЕБРА 1.1. Боргидридный метод В настоящее время способ восстановления солей серебра тетраборгидридоборатом (боргидридом) натрия является наиболее распространенным в процессах

Подробнее

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ Методы количественного определения витаминов ОФС.1.2.3.0017.15 Взамен ст. ГФ XI, вып.2 В данной статье изложены общие принципы

Подробнее

Тема: Молекулярные основы наследственности

Тема: Молекулярные основы наследственности Тема: Молекулярные основы наследственности План лекции: 1. Нуклеиновые кислоты классификация, строение, функции. 2. Макромолекулярная структура ДНК 3. РНК: виды, структура, функции Два вида НК: ДНК (хранение

Подробнее

1. МЕТОДЫ ОТБОРА ПРОБ

1. МЕТОДЫ ОТБОРА ПРОБ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР ВОДА ПИТЬЕВАЯ ГОСТ Методы измерения массовой концентрации 4011-72 общего железа Drinking water. Methods for determination of total iron Дата введения 01.01.74 Настоящий

Подробнее

Девятый класс. Реактивы: Ba(OH) 2, NaOH, H 2 SO 4, HCl, фенолфталеиновая бумага.

Девятый класс. Реактивы: Ba(OH) 2, NaOH, H 2 SO 4, HCl, фенолфталеиновая бумага. Девятый класс Задание: Вам выданы два набора пробирок. 1-й набор содержит растворы Ba(OH) 2, NaOH, H 2 SO 4, HCl, 2-й набор содержит растворы Na 2 SO 4, Pb(CH 3 COO) 2, BaCl 2, NH 4 Cl, MnSO 4, Al 2 (SO

Подробнее

ИФА НАБОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИПОПРОТЕИН-АССОЦИИРОВАННОЙ ФОСФОЛИПАЗЫ А2 ЧЕЛОВЕКА

ИФА НАБОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИПОПРОТЕИН-АССОЦИИРОВАННОЙ ФОСФОЛИПАЗЫ А2 ЧЕЛОВЕКА ИФА НАБОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИПОПРОТЕИН-АССОЦИИРОВАННОЙ ФОСФОЛИПАЗЫ А2 ЧЕЛОВЕКА Кат. CSB-E08319h (96 опред.) ИФА набор предназначен для количественного определения липопротеинассоциированной фосфолипазы

Подробнее

Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов. Сессия 5. Электрофорез в агарозном геле. М.Сомма, М.

Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов. Сессия 5. Электрофорез в агарозном геле. М.Сомма, М. Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 5 Электрофорез в агарозном геле М.Сомма, М.Кверчи WORLD HEALTH ORGANIZATION REGIONAL OFFICE FOR EUROPE ORGANISATION

Подробнее

Спектрофотометрическое измерение концентраций 2-бром-2-нитропропандиола-1,3 (бронитрола) в воздухе рабочей зоны

Спектрофотометрическое измерение концентраций 2-бром-2-нитропропандиола-1,3 (бронитрола) в воздухе рабочей зоны Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации УТВЕРЖДЕНО Госкомсанэпиднадзора России государственный санитарный врач Председатель Главный Российской Федерации Беляев Е.Н.

Подробнее

Лабораторная работа 2. Приготовление растворов и изучение их свойств. Цель работы: исследовать процесс растворения веществ; овладеть методиками

Лабораторная работа 2. Приготовление растворов и изучение их свойств. Цель работы: исследовать процесс растворения веществ; овладеть методиками Лабораторная работа 2. Приготовление растворов и изучение их свойств. Цель работы: исследовать процесс растворения веществ; овладеть методиками приготовления растворов заданной концентрации, изучение их

Подробнее

Основы полимеразной цепной реакции

Основы полимеразной цепной реакции Основы полимеразной цепной реакции Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР) методическое пособие Москва 2012 г. Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР) ОТ СОСТАВИТЕЛЯ Цель пособия «Основы полимеразной

Подробнее

ExpressGene TM DNA Prep

ExpressGene TM DNA Prep ExpressGene TM DNA Prep Готовый реагент для выделения ДНК из образцов с малым содержанием биологических материала Май 2015 г. 8. Выделение ДНК из пятен крови, луковицы волоса и других аналогичных образцов

Подробнее

ИНСТРУКЦИЯ. по применению комплекта реагентов для электрофоретической детекции продуктов амплификации в агарозном геле «ЭФ»

ИНСТРУКЦИЯ. по применению комплекта реагентов для электрофоретической детекции продуктов амплификации в агарозном геле «ЭФ» ИНСТРУКЦИЯ по применению комплекта реагентов для электрофоретической детекции продуктов амплификации в агарозном геле «ЭФ» Форма 1: REF К5-200; Форма 2: REF К5-300; Форма 3: REF К6-200 / VER 28.04.12 /

Подробнее

Изоэлектрофокусирование (ИЭФ).

Изоэлектрофокусирование (ИЭФ). Изоэлектрофокусирование (ИЭФ). Принцип метода: Разделение белков происходит в зависимости от их заряда в градиенте ph создаваемом с помощью синтетических смесей полиаминополикарбоновых кислот (амфолитов)

Подробнее

«Химические основы биологических процессов» * Часть I. Текущие вопросы ТЕМА 1. Что такое жизнь с точки зрения химика. 1. Многообразие и систематика

«Химические основы биологических процессов» * Часть I. Текущие вопросы ТЕМА 1. Что такое жизнь с точки зрения химика. 1. Многообразие и систематика «Химические основы биологических процессов» * Часть I. Текущие вопросы ТЕМА 1. Что такое жизнь с точки зрения химика. 1. Многообразие и систематика 2. Строение клеток 3. Биологические полимеры три основных

Подробнее

Основные генетические механизмы

Основные генетические механизмы Основные генетические механизмы Тренинг «Использование методики Xpert MTB/RIF», г.душанбе, 29 июля 2 августа 2013 г. Презентация подготовлена в рамках проекта USAID «Посилення контролю за туберкульозом

Подробнее

Теоретическая часть. ЭЛЕМЕНТЫ КАЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА.

Теоретическая часть. ЭЛЕМЕНТЫ КАЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА. 1 Теоретическая часть. ЭЛЕМЕНТЫ КАЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА. Химический анализ вещества предполагает определение его качественного и количественного состава. Качественный анализ является первым этапом идентификации

Подробнее

ВОДА ПИТЬЕВАЯ. Метод определения содержания бора

ВОДА ПИТЬЕВАЯ. Метод определения содержания бора ГОСТ Р 51210-98 Г О С У Д А Р С Т В Е Н Н Ы Й С Т А Н Д А Р Т Р О С С И Й С К О Й Ф Е Д Е Р А Ц И И ВОДА ПИТЬЕВАЯ Метод определения содержания бора ГОССТАНДАРТ РОССИИ Москва Предисловие 1 РАЗРАБОТАН Техническим

Подробнее

ВОДА ПИТЬЕВАЯ. Методы измерения массовой концентрации. общего железа. Drinking water. Methods for determination. of total iron

ВОДА ПИТЬЕВАЯ. Методы измерения массовой концентрации. общего железа. Drinking water. Methods for determination. of total iron ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР ВОДА ПИТЬЕВАЯ Методы измерения массовой концентрации общего железа Drinking water. ГОСТ 401172 Methods for determination of total iron Дата введения 01.01.74 Настоящий

Подробнее

NaOH Na + + HSO 4. (1 ступень) HSO 4 H + + SO 4

NaOH Na + + HSO 4. (1 ступень) HSO 4 H + + SO 4 ЗАНЯТИЕ 5 ВОДОРОДНЫЙ ПОКАЗАТЕЛЬ СРЕДЫ. ГИДРОЛИЗ СОЛЕЙ ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ Электролиты вещества, проводящие электрический ток. Процесс распада вещества на ионы под действием растворителя называется электролитической

Подробнее

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА ЛАБОРАТОРНЫЙ СОВЕТ ФЕДЕРАЛЬНОЙ СЛУЖБЫ ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА Качественное

Подробнее

1. ТЕМА: БЕРИЛЛИЙ, МАГНИЙ И ИХ СОЕДИНЕНИЯ

1. ТЕМА: БЕРИЛЛИЙ, МАГНИЙ И ИХ СОЕДИНЕНИЯ 79 1. ТЕМА: БЕРИЛЛИЙ, МАГНИЙ И ИХ СОЕДИНЕНИЯ Опыт 1. Гидроксид бериллия и его свойства В две пробирки внести по 3 4 капли раствора соли бериллия. В каждую пробирку добавить раствор щелочи до образования

Подробнее

Лабораторная работа 2 Методы очистки веществ

Лабораторная работа 2 Методы очистки веществ Лабораторная работа 2 Методы очистки веществ Теоретическая часть Методы очистки и разделения веществ основаны на использовании их различий в химических и физических свойствах. Примерами подобных способов

Подробнее

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ИЗМЕРЕНИЮ КОНЦЕНТРАЦИЙ ОКСИМА ДИКАМБЫ В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ИЗМЕРЕНИЮ КОНЦЕНТРАЦИЙ ОКСИМА ДИКАМБЫ В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ Утверждены Министерством здравоохранения СССР 29 июля 1991 г. N 6117-91 МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ИЗМЕРЕНИЮ КОНЦЕНТРАЦИЙ ОКСИМА ДИКАМБЫ В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ Cl / Мол.

Подробнее

Лото «Химический состав клетки» (игра для 10 класса)

Лото «Химический состав клетки» (игра для 10 класса) МОУ «Грабцевская средняя общеобразовательная школа» МР «Ферзиковский район» Лото «Химический состав клетки» (игра для 10 класса) Подготовила Учитель биологии Грищенко О.В. Лото «Химический состав клетки»

Подробнее

Водородный показатель ph Индикаторы Суть гидролиза Типы солей Алгоритм составления уравнений гидролиза солей Гидролиз солей различных типов Способы

Водородный показатель ph Индикаторы Суть гидролиза Типы солей Алгоритм составления уравнений гидролиза солей Гидролиз солей различных типов Способы Водородный показатель ph Индикаторы Суть гидролиза Типы солей Алгоритм составления уравнений гидролиза солей Гидролиз солей различных типов Способы подавления и усиления гидролиза Решение тестов В4 Водородный

Подробнее

ИНСТРУКЦИЯ. по применению тест-систем для выявления инфекционных патогенов методом ПЦР в режиме реального времени

ИНСТРУКЦИЯ. по применению тест-систем для выявления инфекционных патогенов методом ПЦР в режиме реального времени ИНСТРУКЦИЯ по применению тест-систем для выявления инфекционных патогенов методом ПЦР в режиме реального времени ООО «Биологическая среда», Российская Федерация, 127015, город Москва, улица Большая Новодмитровская

Подробнее

Так вот ты какой горячий старт

Так вот ты какой горячий старт Так вот ты какой горячий старт Сразу хотим обратить Ваше внимание, что предлагаемая статья не является научной публикацией, а представляет собой обобщение нашего опыта по работе с полимеразами и подбору

Подробнее

Тема 1. Химический состав клетки Задания части А

Тема 1. Химический состав клетки Задания части А Тема 1. Химический состав клетки Задания части А Выберите один ответ, который является наиболее правильным 1. Назовите органические соединения, которые содержатся в клетке в наибольшем количестве (в %

Подробнее

Спектрофотометрическое определение ионов алюминия (III) и железа (III) в растворе с применением метода наименьших квадратов

Спектрофотометрическое определение ионов алюминия (III) и железа (III) в растворе с применением метода наименьших квадратов Лабораторная работа к практикуму «Спектрофотометрические методы анализа» Спектрофотометрическое определение ионов алюминия (III) и железа (III) в растворе с применением метода наименьших квадратов Разработчики:

Подробнее

Учитель биологии ГБОУ СОШ 277 Кировского района Буянов А.В.

Учитель биологии ГБОУ СОШ 277 Кировского района Буянов А.В. Учитель биологии ГБОУ СОШ 277 Кировского района Буянов А.В. Название «нуклеиновые кислоты» происходит от латинского слова «нуклеус», т.е. ядро. Они впервые были обнаружены и выделены из ядер клеток. Этот

Подробнее

Синтез 1 Бутилацетат (бутиловый эфир уксусной кислоты) O-CH 2 C T

Синтез 1 Бутилацетат (бутиловый эфир уксусной кислоты) O-CH 2 C T 1 Синтез 1 Бутилацетат (бутиловый эфир уксусной кислоты) S - - Уравнение основной реакции: H S - - H План работы: 1. Расчет синтеза и оформление лабораторного журнала 2. Подготовка к синтезу: получение

Подробнее

ИНФОРМАЦИОННЫЙ ЛИСТ. Дата изменения: версия 3

ИНФОРМАЦИОННЫЙ ЛИСТ. Дата изменения: версия 3 ИНФОРМАЦИОННЫЙ ЛИСТ Дата изменения: 05.10.15 версия 3 Информируем Вас о дополнениях и уточнениях в инструкции по применению набора реагентов «АмплиСенс HCV-Монитор-FL» 1. ВНИМАНИЕ! При использовании автоматической

Подробнее

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН Западно-Казахстанский государственный университет им.м.утемисова РАБОЧАЯ УЧЕБНАЯ ПРОГРАММА MONI 1101 Молекулярные основы наследственности и изменчивости

Подробнее

Контрольно-измерительное оборудование OFI Определение содержания хлорид иона, инструкциистраница 1 из 4

Контрольно-измерительное оборудование OFI Определение содержания хлорид иона, инструкциистраница 1 из 4 Контрольно-измерительное оборудование OFI Определение содержания хлорид иона, инструкциистраница 1 из 4 Буровые растворы на водной основе Данный тест предназначен для измерения суммарной концентрации растворимых

Подробнее

Курс лекций (МТФ, 2-3 курс) Тимакова Евгения Владимировна ЛЕКЦИЯ 11

Курс лекций (МТФ, 2-3 курс) Тимакова Евгения Владимировна ЛЕКЦИЯ 11 Курс лекций (МТФ, 2-3 курс) Тимакова Евгения Владимировна ЛЕКЦИЯ 11 Закон Рауля и отклонения от него. Диаграммы кипения жидкостей с различной взаимной растворимостью. Физико-химические основы перегонки

Подробнее