Федоренко Татьяна Владимировна ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ЦИТОКИНОВ В МОНИТОРИНГЕ ОСЛОЖНЕНИЙ ПРИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ПОЧКИ

Save this PDF as:
Размер: px
Начинать показ со страницы:

Download "Федоренко Татьяна Владимировна ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ЦИТОКИНОВ В МОНИТОРИНГЕ ОСЛОЖНЕНИЙ ПРИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ПОЧКИ"

Транскрипт

1 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации На правах рукописи Федоренко Татьяна Владимировна ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ЦИТОКИНОВ В МОНИТОРИНГЕ ОСЛОЖНЕНИЙ ПРИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ПОЧКИ Клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: Колесникова Наталья Владиславовна, доктор биологических наук, профессор Пашкова Ирина Анатольевна доктор медицинских наук, доцент Краснодар 2019

2 2 Оглавление Введение... 5 Глава 1. Современные представления о механизмах отторжения аллогенной почки и методах его диагностики (Обзор литературы) Трансплантация как современный метод лечения терминальной стадии хронической болезни почек Иммунологические механизмы отторжения трансплантируемых солидных органов Лабораторные критерии диагностики отторжения почки Диагностическая роль цитокинов в реакциях отторжения трансплантата Глава 2. Материалы и методы исследования Объект исследования Дизайн исследования Методы иммунологических исследований Определение в плазме концентрации цитокиновых биомаркеров Анализ и идентификация HLA-антител HLA-генотипирование реципиентов и доноров для трансплантации солидных органов Оценка перекрестной совместимости с помощью теста комплементзависимой цитототоксичности (CDC) Статистический анализ данных Глава 3. Изучение предикторной роли цитокинов в мониторинге посттрансплантационных осложнений... 54

3 Оценка ассоциации предоперационного уровня про- и противовоспалительных интерлейкинов с выработкой анти-hla антител и развитием отторжения почки после трансплантации Оценка ассоциации предоперационного уровня факторов роста с выработкой анти-hla антител и развитием отторжения почки после трансплантации Оценка ассоциации предоперационного уровня хемокинов с выработкой анти-hla антител и развитием отторжения почки после трансплантации Оценка ассоциации предоперационного уровня интерферонов с выработкой анти-hla антител и развитием отторжения почки после трансплантации Оценка ассоциации предоперационного уровня факторов некроза опухоли с выработкой анти-hla антител и развитием отторжения почки после трансплантации Резюме Глава 4. Диагностическая роль цитокинов в посттрансплантационном мониторинге осложнений Оценка динамики про- и противовоспалительных интерлейкинов в различные сроки после трансплантации, ассоциированных с осложненным и не осложненным течением посттрансплантационного периода Оценка динамики факторов роста в различные сроки после трансплантации, ассоциированных с осложненным и не осложненным течением посттрансплантационного периода Оценка динамики хемокинов в различные сроки после трансплантации, ассоциированных с осложненным и не осложненным течением посттрансплантационного периода... 97

4 Оценка динамики интерферонов в различные сроки после трансплантации, ассоциированных с осложненным и не осложненным течением посттрансплантационного периода Оценка динамики факторов некроза опухоли в различные сроки после трансплантации, ассоциированных с осложненным и не осложненным течением посттрансплантационного периода Резюме Заключение Перспективы дальнейшей разработки темы Выводы Практические рекомендации Список сокращений Список литературы Приложение

5 5 Введение Актуальность темы исследования и степень ее разработанности Трансплантация почки является методом выбора терапии для большинства пациентов с терминальной стадией почечной недостаточности. В настоящее время накоплен опыт по трансплантации органов, созданы фармакологические препараты для проведения эффективной иммуносупрессивной терапии, совершенствуются схемы и методы иммуносупрессии. Однако, несмотря на прогресс, достигнутый в области иммуносупрессии, отторжение трансплантата остается основной причиной заболеваемости пациентов после трансплантации почки, поскольку острое отторжение увеличивает риск развития хронической нефропатии аллотрансплантата [92], а отдаленные результаты лечения не являются оптимальными и мало изменились за последние несколько десятилетий [136]. Клиническое течение посттрансплантационного периода у разных людей значительно различается, что обуславливает развитие различной степени тяжести и выраженности осложнений, существенно влияющих на качество жизни пациента, что, в свою очередь, требует тщательного клинико-лабораторного контроля указанного периода. Несмотря на значительное снижение частоты острого отторжения трансплантата почки за счет внедрения более эффективных и мощных иммуносупрессивных препаратов в последние три десятилетия, недостаточность объективных неинвазивных предикторов острого отторжения затрудняет оптимизацию антирецидивной терапии. Между тем, изменения клинико-биохимических показателей не являются ранними и специфическими маркерами воспаления, а пункционная тонкоигольная биопсия, считающаяся в настоящее время «золотым стандартом», в силу своей инвазивности может привести к осложнениям инфекционно-воспалительного характера. К тому же, не исключены расхождения гистологической картины с клинико-лабораторными данными [2, 18]. В этой связи с поиск неинвазивных молекулярных маркеров

6 6 иммунологического конфликта является приоритетным направлением в трансплантационной иммунологии с 80-х годов ХХ века [119]. Иммунологическая реакция на донорский орган включает целый комплекс последовательных клеточных и молекулярных процессов, которые суммарно обуславливают клиническую картину отторжения [7]. Известно, что наиболее значительные изменения в иммунной системе реципиента происходят в первые 2-3 недели после трансплантации [161], в течение которых иммунный ответ на аллоантигены значительно превышает таковой на антигены микроорганизмов. Это обуславливает актуальность изучения гуморальных факторов иммунитета в различные сроки после трансплантации, включая самые ранние, что важно для определения этапов формирования посттрансплантационного иммунитета, развития процессов отторжения или иммунного ответа на присоединившуюся инфекцию, и способствовать ранней малоинвазивной диагностике и проведению дифференциальной диагностики осложнений различной природы. Известно, что после изъятия из тела донора и пересадки реципиенту, трансплантат неизбежно испытывает негативное влияние таких факторов, как ишемия и реперфузия, следствием чего становится активация разнообразных генов, особенно, генов цитокинов [21], играющих важную роль как в местных, так и в системных иммунных процессах донора и реципиента [24]. В связи с этим, в научной литературе появились работы, свидетельствующие о диагностической значимости некоторых цитокинов при трансплантации аллогенных органов. В частности, высказывается предположение, что повышенные уровни растворимого рецептора scd30 до и после трансплантации коррелируют с увеличением частоты отторжения [203] и ухудшения прогноза трансплантации почки [169, 71]. Существует историческая гипотеза, предполагающая, что переход с Тh1 на Тh2 тип иммунного ответа способствует выживанию аллотрансплантата, облегчает толерантность и препятствует атеросклерозу [102, 194]. Ряд других работ свидетельствует о том, что при развитии острого отторжения почечного трансплантата повышен уровень IL-10 и IFN-гамма по сравнению со стабильными

7 7 пациентами, в то время как в период до трансплантации различий между содержанием цитокинов в группах обследуемых не было [114]. Между тем имеются данные, указывающие на возможность использования некоторых цитокинов в качестве предикторов острого отторжения: показано, что накануне трансплантации в крови у пациентов с развившимся впоследствии острым отторжением достоверно повышен уровень хемокина CXCL9 в крови [182]. Интерес также представляет анализ цитокинов, продуцируемых основными регуляторными Т-хелперами Тh1 и Тh2 [210]. Кроме того, экспериментально доказана способность IL-33 повышать выживание сердечного аллотрансплантата путем переключения синтеза цитокинов Th1 на Th2 [227]. Учитывая известную способность цитокинов регулировать деструкцию тканей при воспалении посредством активации нейтрофильных лейкоцитов [55], можно судить об их участии в патогенезе не только острого, но и хронического отторжения [115]. С другой стороны, существует мнение, что в определении судьбы трансплантированного органа важную роль играют донорские антитела, являющиеся причиной 60% функциональной несостоятельности трансплантата и традиционно рассматриваемых как антитела, направленные против донорских антигенов HLA [151]. Известно также, что в посттрансплантационных осложнениях отрицательную роль играют и другие антитела: антиэндотелиальные [238], антитела против рецепторов 1 типа к ангиотензину II [75, 60] а так же против А-рецепторов к эндотелину-1 [33]. Кроме того, существовавшее ранее мнение о патогенетической значимости только антител класса IgG сегодня оспорено, в частности, оказалось, что IgM также могут быть связаны с некоторыми неблагоприятными результатами трансплантации [198]. Уточнено также, что если ранее наличие предсуществующих патогенетически значимых антител являлось противопоказанием к трансплантации из-за их способности лизировать донорские лимфоциты при наличии белков системы комплемента [167], то в настоящее время появление антител de novo уже после трансплантации также может быть прогностически неблагоприятным признаком [69, 166]. В целом это расширяет представления о диагностической значимости

8 8 антител в прогнозе посттрансплантационных отторжений, и позволяет думать, что наличие как предсуществующих антител, так и антител, образовавшихся после трансплантации не является абсолютным признаком отторжения трансплантата, что в свою очередь обуславливает интерес к дальнейшему изучению данного вопроса и к поиску новых более надежных и ранних критериев посттрансплантационного отторжения. Таким образом, исследования в области поиска ранних и малоинвазивных биомаркеров острого и хронического отторжения трансплантата почки ведутся весьма интенсивно. Особенно перспективны исследования, опирающиеся на понимание закономерностей иммунопатогенеза реакции отторжения трансплантата. Однако, при анализе научной литературы нами не были обнаружены работы, связанные со сравнительной оценкой диагностической роли острого отторжения аллотрансплантата, с наличием/отсутствием специфических HLA-антител реципиента и различных классов цитокинов (про- и противовоспалительных, хемокинов, ростовых факторов), произведенной до трансплантации донорской почки и в течение длительного посттрансплантационного периода, что и послужило основой для диссертационного исследования. Цель исследования Выявить патогенетическую значимость и диагностическую информативность различных групп цитокинов, как предикторов острого отторжения аллогенной почки и биомаркеров характера течения посттрансплантационного периода. Задачи исследования 1. У реципиентов с хронической болезнью почек и с различными клиническими исходами трансплантации почки и наличием/отсутствием

9 9 антител к лейкоцитарным антигенам человека главного комплекса гистосовместимости определить содержание в плазме цитокинов различных групп (про- и противовоспалительных интерлейкинов, факторов роста, хемокинов, интерферонов и факторов некроза опухоли) за 6 часов до трансплантации аллогенной почки. 2. На основе анализа и систематизации полученных данных выявить цитокины предикторы острого отторжения аллогенной почки, а также биомаркеры благоприятного посттрансплантационного периода. 3. Определить в периферической крови реципиентов с различными клиническими исходами трансплантации почки и наличием/отсутствием антител к лейкоцитарным антигенам человека содержание цитокинов различных групп (про- и противовоспалительных интерлейкинов, факторов роста, хемокинов, интерферонов и факторов некроза опухоли) в различные сроки посттрансплантационного периода (на 7 день, через 30, 90 и 180 дней). 4. На основе анализа и систематизации полученных данных выявить цитокины посттрансплантационные биомаркеры осложненного и благоприятного посттрансплантационного периода и их связь с ранними предикторами острого отторжения. 5. Определить содержание цитокинов до и после трансплантации аллогенной почки как предикторы появления антител к лейкоцитарным антигенам человека главного комплекса гистосовместимости в посттрансплантационный период. 6. Расширить представление о патогенетической значимости различных групп цитокинов в реакциях острого отторжения трансплантата почки и разработать алгоритм диагностики острого отторжения трансплантата на основе пред- и посттрансплантационных цитокиновых биомаркеров.

10 10 Методология и методы исследования Методологической основой диссертационного исследования явилось последовательное применение методов научного познания наблюдение и анализ. Работа выполнена в дизайне проспективного и ретроспективного исследования с использованием молекулярно-генетических, иммунологических и статистических методов исследования. Для выполнения цели исследования, реализации поставленных задач исследования и обоснования основных положений были использованы теоретический анализ литературы, современные лабораторные методы исследования и методы статистической обработки данных. Объектом исследования были различные группы цитокинов периферической крови 58 взрослых пациентов с хронической болезнью почек (ХБП) реципиентов аллогенной почки диализного отделения «ГБУЗ НИИ-ККБ 1» г. Краснодара, которым была выполнена трансплантация за период с января 2015 года по август 2016 года. Концентрация цитокинов определялась до трансплантации и в различные сроки послеоперационного периода (на 7 день, через 1 месяц, 3 месяца, 6 месяцев) всего было проанализировано 310 образцов по 47 параметрам. Методы исследования 1. Иммунологические: - определение у реципиентов концентрации цитокиновых биомаркеров (интерлейкинов IL-1a, IL-1b, IL-1RA,, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL- 10, IL-12p70, IL-13, IL-15, IL-17A, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, IL-31, IL- 33; 2) интерферонов IFN-α, IFN-ỵ; 3) факторов некроза опухоли TNF-α, TNF-β; 4) хемокинов Eotaxin, GRO-α, IL-8(CXCL8), IP-10, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, MIG, SDF-1α, RANTES; 5) факторов роста GM-CSF, NGF-β, BDNF, EGF, FGF-2, HGF, LIF, PDGF-BB, PIGF-1, SCF, VEGF-A, VEGF-D) с

11 11 использованием технологии xmap на сформированной мультиплексной панели Simplex ProcartaPlex (ebioscience, США). - анализ и идентификация HLA-антител у реципиентов при помощи набора реагентов LIFCODES LifeScreen Deluxe (Immucor Transplant Diagnostics, США) с применением проточного флуоресцентного анализатора Luminex (Luminex Corporation, США). - тест комплементзависимой цитототоксичности (CDC) с визуальной оценкой цитотоксической реакции с помощью инвертированного микроскопа Axio Observer (Zeiss, Германия). 2. Молекулярно-генетические HLA типирование реципиентов и доноров по локусам HLA-A, HLA-B, HLA-DRB1 системы HLA для трансплантации солидных органов с использованием специфических праймеров SSP и SSO метода специфических зондов: - выделение геномной ДНК пациентов из крови, взятой с антикоагулянтом на приборе автоматического выделения ДНК NorDiag Arrow (NorDiag, Норвегия); - генотипирование методом SSO выполняли на реагентах LifeCodes HLA- SSO HLA-A, LifeCodes HLA-SSO HLA-B, LifeCodes HLA-SSO HLA-DRB1 низкого разрешения (Immucor, США), с детекцией результата на анализаторе Luminex 100/200 (Luminex Corporation, США); - генотипирование методом SSP выполняли на реагентах OLERUP SSP HLA TYPING KIT низкого разрешения (Olerup, Швеция), с детекцией результата в агарозном геле. 3. Статистические: - с использованием статистической программы «GraphPad Prism 6.0»; - с использованием U-критерия Манна Уитни (для сравнения групп пациентов по количественным показателям для малых выборок с ненормальным распределением); - с использованием критерия корреляции Пирсона (для оценки связи между признаками);

12 12 - с использованием Т критерия Уилкоксона (для оценки различий между измерениями одной и той же совокупности в разное время и в разных условиях); - с использованием метода однофакторного дисперсионного анализа - ANOVA (для оценки несвязанных совокупностей более двух с ненормальным распределением критерий Краскела-Уоллиса, с нормальным распределением критерий Фридмана). Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора Степень достоверности результатов определяется объемом фактического материала, использованием современных лабораторных методов исследования, адекватной статистической обработкой полученных результатов и соответствием поставленной цели решаемым задачам. Исследования выполнены на сертифицированном лабораторном оборудовании: проточном флуоресцентном анализаторе Luminex 100/200 (Luminex Corporation, США), инвертированном микроскопе Axio Observer (Zeiss, Германия); приборе автоматического выделения ДНК NorDiag Arrow (NorDiag, Норвегия); трансиллюминаторе EX-20M (Vilber Lourmat, Франция), камере для проведения электрофореза «SE-2» (Хеликон, Россия); амплификаторе (AplyBiosistems, США); сканирующем спектрофотометре Biowave DNA (Biochrom, Великобритания). Обработка данных проведена с использованием пакетов прикладной статистической программы «Graph Pad Prism version 6.0» (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Все вышеперечисленное подтверждает достоверность полученных результатов. Основные положения диссертации обсуждены на XIV конференции иммунологов Урала с международным участием (28-29 августа, 2017, Челябинск); Международной научно-практической конференции «Молекулярная диагностика

13 » (27-28 сентября, 2018, Минск); Объединенном иммунологическом форуме (24-29 июня, 2019, Новосибирск). Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии во всех этапах выполнения диссертационной работы. Основная идея, планирование научной работы, включая формулировку рабочей гипотезы, определение методологии и общей концепции диссертационного исследования проводились совместно с научным руководителем Колесниковой Натальей Владиславовной, доктором биологических наук, профессором кафедры клинической иммунологии, аллергологии и лабораторной диагностики ФПК и ППС КубГМУ Минздрава России. Цель и задачи сформулированы совместно с научным руководителем. Дизайн исследования разработан диссертантом совместно с научным руководителем. Анализ современной отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме, фракционирование периферической крови, получение плазмы и проведение всех методов исследования проведен лично диссертантом. Проспективный анализ медицинских карт 58 реципиентов аллогенной почки диализного отделения «ГБУЗ НИИ-ККБ 1» г. Краснодара, которым была выполнена трансплантация за период с января 2015 года по август 2016 года, выполнен при участии и консультативной помощи научного руководителя доцента кафедры терапии 1 ФПК и ППС КубГМУ Минздрава России, руководителя краевого координационного центра органного донорства «НИИ- ККБ 1 им. проф. С.В. Очаповского» Министерства здравоохранения Краснодарского края, доктора медицинских наук Пашковой Ирины Анатольевны. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, из них 4 статьи в рецензируемых научных журналах, из перечня рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации результатов кандидатских диссертаций.

14 14 Положения, выносимые на защиту 1. Различные клинические исходы трансплантации почки, а также наличие/отсутствие антител к лейкоцитарным антигенам человека главного комплекса гистосовместимости сопровождаются изменениями ряда цитокинов на предтрансплантационном этапе (за 6 часов до трансплантации аллогенной почки). В качестве предикторов острого отторжения трансплантируемой почки можно использовать оцениваемые за 6 часов до трансплантации в плазме у реципиентов с хронической болезнью почек цитокины: интерлейкин 17A, интерлейкин 1RA, интерлейкин 33, моноцитарный хемоаттрактантный белок, эозинофильный хемотаксический белок, нейротрофический фактор роста. Биомаркерами благоприятного посттрансплантационного периода можно считать характер изменения за 6 часов до трансплантации интерлейкина 27, интерлейкина 7 и ингибирующего лейкоз фактора. 2. Определение плазменной концентрации цитокинов у реципиентов аллогенной почки в различные периоды после трансплантации позволяет проводить дополнительную оценку клинических исходов трансплантации аллогенной почки, связанных с дальнейшим развитием острого отторжения, выработкой антител к лейкоцитарным антигенам человека главного комплекса гистосовместимости, сроком наблюдения или для подтверждения благоприятного клинического исхода трансплантации. 3. Для диагностики вероятности появления антител к лейкоцитарным антигенам человека главного комплекса гистосовместимости после трансплантации целесообразно опредление предтрансплантационного повышения концентраций интерлейкина 1β, интерлейкина 18, интерлейкина 6, нейтрофилактивного белка, пептида, активирующего нейтрофилы, пептида, индуцирующего интерферон гамма, белка хронического воспаления и адгезии моноцитов на клетки эндотелия и тромбоцитарного фактора роста в установленных пределах, тогда как в

15 15 посттрансплантационный период их выявление связано с высоким уровнем содержания интерлейкина 12р70 и белка хронического воспаления и адгезии моноцитов на клетки эндотелия. Научная новизна 1. Впервые доказана диагностическая значимость цитокинов плазмы реципиентов с хронической болезнью почек, оцениваемых за 6 часов до трансплантации аллогенной почки: достоверными предикторами острого отторжения аллотрансплантата почки является увеличение содержания IL- 17A, IL-33, IL-1RA, CCL2 и снижение BDNF и CCL11, а биомаркерами благоприятного посттрансплантационного периода - низкий уровень содержания IL-27, IL-7 и LIF. 2. Получены данные о возможности использования некоторых цитокинов плазмы реципиентов аллогенной почки в динамике посттрансплантационного периода (на 7 день, через 30 дней, через 90 дней и 180 дней) как биомаркеров осложненного течения посттрансплантационного периода (высокий уровень содержания IL-17А, IL-1RA, IL-33, LIF, CCL2 и снижение концентрации BDNF и CCL11) и как критериев благополучного выживания аллотрансплантата (низкий уровень содержания IL-6, выраженный дефицит IL-17А и IL-27, концентрация IL-33 в пределах нормы). 3. Впервые доказано, что диагностическими критериями образования HLAантител у реципиентов аллогенной почки в посттрансплантационный период является достоверное повышение за 6 часов до трансплантации плазменной концентрации IL-1β, IL-18, IL-6, CХCL1, CХCL8, CХCL10, CCL5 и PDGF-BB в установленных пределах, тогда как в посттрансплантационный период выявление HLA-антител ассоциировано с высоким уровнем содержания IL-12р70 и CCL5.

16 16 Теоретическая и практическая значимость работы Результаты проведенных исследований могут быть использованы для научно обоснованной оптимизации прогноза и диагностики посттрансплантационных осложнений при пересадке почки. Оценка содержания различных классов цитокинов (про- и противовоспалительных интерлейкинов, хемокинов, факторов роста) на этапе перед трансплантацией и в динамике мониторирования послеоперационного периода (до 6 месяцев) позволяет уточнить их патогенетическую значимость в механизмах отторжения почечного трансплантата. Полученные результаты о диагностической значимости цитокинов (Патент на изобретение «Способ прогнозирования риска отторжения почки до ее трансплантации» от года) могут быть использованы в практическом здравоохранении для прогноза острого отторжения трансплантируемой почки пациентам с ХБП. Внедрение результатов исследования в практику Результаты исследования используются в учебном процессе на кафедре клинической иммунологии, аллергологии и лабораторной диагностики ФПК и ППС, клинической патофизиологии в лекционном цикле по фундаментальной и клинической иммунологии по теме «Трансплантационный иммунитет» ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России при проведении занятий; внедрены в практику работы клинико-диагностической лаборатории, нефрологического отделения 2 и в отделении анестезиологии и реанимации 7 «ГБУЗ НИИ-ККБ 1 им. проф. С.В. Очаповского».

17 17 Глава 1. Современные представления о механизмах отторжения аллогенной почки и методах его диагностики (Обзор литературы) 1.1 Трансплантация как современный метод лечения терминальной стадии хронической болезни почек В настоящее время трансплантация является наиболее оптимальным вариантом терапии пациентов с терминальной недостаточностью органов и если пересадка легких или сердца представляет собой единственный ее вариант, то трансплантация почки имеет многие преимущества перед диализом: большее улучшение качества жизни, более низкая смертность по сравнению с пациентами на диализе [95]. Однако на сегодняшний день потенциальная польза от трансплантации органов резко ограничена не только недостаточной доступностью донорских органов (трансплантатов), но и недостаточной их выживаемостью по сравнению с ожидаемой жизнью не трансплантированных органов [230]. Среди причин низкого периода полужизни трансплантированных органов сегодня выделяют как неиммунные (повреждения в результате ишемии\реперфузии) так и иммунологические причины [157]. С точки зрения иммунных причин долгое время единственной причиной считалось отторжение трансплантата в результате реакций клеточного иммунитета, однако научный прогресс в понимании тонких механизмов иммунологического отторжения не позволяет рассматривать иммунные клетки в качестве единственных участников данного процесса. Сегодня общепризнанно, что гуморальные иммунные факторы могут рассматриваться в качестве ключевых, определяющих конечную судьбу трансплантируемого органа [93]. Ежегодно в России выполняется около 6,4 трансплантаций почки на 1 млн. населения, при этом доминирует трансплантация трупной почки (80,4%). В «листе ожидания» трансплантации почки, на конец 2015 г., по данным регистра Российского трансплантологического общества, состояло 4167 потенциальных реципиента (это около 19,1% от общего числа пациентов, получающих

18 18 заместительную почечную терапию), а число реципиентов с функционирующим почечным трансплантатом достигло 8435 человек. В Краснодарском крае обеспеченность населения трансплантацией почки выше средней по России и составляет 68 больн./млн [15]. Острое отторжение трансплантируемой почки увеличивает риск развития хронической нефропатии и уменьшения периода полужизни трансплантата, то есть большое значение приобретает понятие долгосрочного выживания аллотрансплантата [92]. Недостаточная функция аллотрансплантата почки в первые недели после трансплантации обуславливает использование диализа, связанного с так называемой отсроченной функцией трансплантата, что также является еще одной важной клинической проблемой при трансплантации почки, увеличивая риск острого отторжения и потери трансплантата в течение 3 лет после трансплантации [224]. Первичная дисфункция трансплантата это синдром, охватывающий широкий спектр от легкого до тяжелого повреждения органа, которое происходит в течение 72 часов после трансплантации. Кроме того, первичная дисфункция трансплантата (ПДТ) имеет значительное влияние на краткосрочные и долгосрочные результаты его выживаемости [205]. Патогенез первичной дисфункции трансплантата является сложным и зависит от донора, реципиента, технических факторов и различных комбинаций всего перечисленного. ПДТ развивается как воспалительный ответ, а также как комплекс иммунологических процессов [38]. Острое гуморальное отторжение составляет от 15% до 20% от отторжения трансплантата в течение первого года после трансплантации, несмотря на иммуносупрессивную терапию [141] и является одной из основных причин его ограниченной выживаемости, кроме того, острое отторжение представляет собой основной фактор риска развития хронического отторжения [146]. В последние годы уделяется большое внимание биохимическим, иммунологическим, молекулярно-генетическим исследованиям, благодаря

19 19 которым удалось получить представление о процессах, лежащих в основе повреждения трансплантата при отторжении. 1.2 Иммунологические механизмы отторжения трансплантируемых солидных органов Активация элементов иммунной системы может произойти на любом этапе трансплантации быть следствием тканевой травмы, полученной во время извлечения органа, ишемии и реперфузии. По сути, клетки ткани и лейкоциты донорского органа, являются потенциально опасными для окружающих тканей в месте трансплантации и могут инициировать внутриклеточные сигнальные пути для мобилизации воспалительной и иммунной реакции. Попадая в организм реципиента и перфузируясь его кровью, трансплантат становится причиной и объектом иммунологической реакции со стороны врожденного и адаптивного иммунитета, которая включает комплекс последовательных клеточных и гуморальных процессов, обеспечивающих клиническую картину отторжения [7]. Врожденный иммунитет, как первая линия обороны от инфекционных антигенов, включает систему физических и химических барьеров, протеинов системы комплекта, а также иммунных клеток макрофагов, нейтрофилов, натуральных клеток-киллеров, экспрессирующих рецепторы врожденного иммунитета [180]. В частности, клетки врожденного иммунного ответа снабжены так называемыми рецепторами распознавания образов (PRR), позволяющие им распознавать патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMPS) [165, 207]. Связывание PRR-рецепторов клеток врожденного иммунитета с патогенассоциированными молекулярными паттернами приводит к их активации с последующей продукцией и секрецией провоспалительных молекул для индукции воспаления и ликвидации патогенов. В очаге воспаления погибают не только микробные патогены, но и собственные клетки тканей, из которых высвобождаются особые молекулы, ассоциированные с воспалительным повреждением клеток (белки теплового шока, нуклеопротеиды), а также при

20 20 разрушении клеток в результате реакции отторжения трансплантата, которые также распознаются PRR-рецепторами [165, 207, 152]. Известны сведения о том, что высокий уровень инфильтрации макрофагами аллотрансплантатов ассоциирован с выраженным их отторжением и является индикатором плохого исхода трансплантации [143]. Показано, в частности, что моноциты/макрофаги ухудшают функцию трансплантата за счет высвобождения растворимых иммунорегуляторных факторов цитокинов [91]. Например, провоспалительный цитокин TNF-α, обнаруживаемый в аллотрансплантатах, стимулирует функции макрофагов и увеличивает экспрессию антигена II класса MHC при отторжении [103]. В этой связи интерес представляют экспериментальные данные о том, что истощение аллотрансплантата по макрофагам может улучшить его качество, как трансплантата [32]. Среди клеток врожденного иммунитета важную роль в механизмах иммунного ответа на трансплантат играют и аллореактивные естественные киллеры (NK-лимфоциты): показано, что инфильтрация почки NK-клетками [163], как и увеличение их в периферической крови реципиентов вызывают острое отторжение трансплантата почки [89]. При этом наряду с количественным увеличением NK-клеток, отмечена и их функциональная активация: в системе in vitro выявлена повышенная цитотоксичность NK клеток реципиента по сравнению с донорскими клетками периферической крови [45]. Наряду с врожденным иммунитетом в развитии отторжения трансплантата принимают участие клеточные (Т- и В-лимфоциты) и гуморальные (антитела, цитокины) факторы адаптивного иммунитета [181, 4]. Клетки адаптивного иммунитета способны сохранять память о предыдущих встречах с антигенами, обеспечивая повторный иммунный ответ как более быстрый и мощный, что полезно в случае инфекционного агента, но крайне негативно в случае отторжения трансплантата. Таким образом, отторжение аллотрансплантата представляет собой сложный процесс, требующий взаимодействия как врожденного, так и приобретенного (адаптивного) иммунного ответа [8, 181, 220, 64]. После

21 21 трансплантации в результате повреждения тканей, высвобождающиеся молекулы повреждения, которые распознаются PRR клетками врожденного иммунитета, которые активируют и продуцируют провоспалительные цитокины, индуцирующие воспаление и стимулирующие адаптивный иммунитет основной эффектор процесса отторжения. Т-клеточное повреждение трансплантата обусловлено эффектами как CD4+ Т-хелперами (Тh1, Тh2, Th17-лимфоциты, регуляторных Foxp3+Treg), так и Т- цитотоксическими/супрессорами (CD8+) [25, 221, 171]. При этом эффекты Т- хелперов опосредованы продуцируемыми ими цитокинами: Th1 и Th17 производят ряд провоспалительных цитокинов (IFN-γ, TNF-α, IL-17), а Th2 выделяют противовоспалительные цитокины, такие как IL-10 и IL-4. Обсуждение роли клеток Foxp3+Treg в вопросах Т-клеточного отторжения трансплантируемой почки весьма неоднозначно [184]. По данным одних исследователей, высокая инфильтрация этими клетками ассоциируется с более благоприятными результатами трансплантации у пациентов с отторжением [39, 120, 211], тогда как другие исследования, не выявили никакой ассоциации между острым отторжением и обнаружением Foxp3 + Treg при трансплантации почки [74]. Кроме того, Foxp3+ регуляторные Т-клетки способны мигрировать в трансплантированный орган, чтобы модулировать там воспалительную реакцию [109]. Между тем в пользу клинико-диагностической роли данной субпопуляции Т-хелперов свидетельствуют сведения о том, что трансплантация сама по себе индуцирует повышенную генерацию регуляторных Т-клеток CD25+CD4+FOXP3+, необходимых для ограничения антитрансплантационного иммунного ответа. В частности, показано, что клетки Foxp3 + Treg подавляют продукцию IFN-γ Th1-клетками, который, напротив стимулирует работу цитотоксических Т-киллеров, Т-эффекторов гиперчувствительности замедленного типа, отторгающих аллогенный трансплантат [181]. В частности, цитотоксические лимфоциты высвобождают из своих цитотоксических гранул перфорин и гранзим B, которые попадая в клетку-мишень вызывают ее апоптоз [152].

22 22 Современные данные свидетельствуют также об определенной корреляции между острым отторжением и эффекторными аллореактивными Т-клетками памяти [188, 80], которые по сравнению с их наивными аналогами, являются более долгоживущими, могут быть полностью реактивированы минимальной костимуляцией, менее чувствительны к новым иммуносупрессантам [62]. В связи с этим, сенсибилизация Т-клеток более вероятна в начальный период после трансплантации, так как предварительно сформированные Т-клетки памяти готовы к перекрестной реакции с донорскими аллоантигенами, что в конечном итоге приводит к отторжению аллотрансплантата. Если Th1 вызывают отторжение трансплантата посредством активации цитотоксических CD8+ Т-лимфоцитов, то CD4+ Th2 могут вызвать реакцию отторжения, опосредованную антителами (антителозависимая клеточная цитотоксичность) или эозинофилами в результате секреции IL-4, IL-5 и IL-13 [10, 144]. Аллогенное распознавание может происходить через два уникальных, но не взаимоисключающие пути: прямой и непрямой пути презентации антигена. Прямой путь включает в себя распознавание неизмененных донорских молекул главного комплекса гистосовместимости (MHC) на клеточной поверхности, как правило, с помощью антигенпрезентирующих клеток. Оба класса CD8+ и CD4+ Т-клеток могут непосредственно распознавать донорские молекулы МНС I и II класса, соответственно, однако непрямой путь предполагает презентацию обработанных донорских антигенов с помощью антигенпрезентирующих клеток. Наряду с этим A. Bharat и T. Mohanakumar (2007) описали и, так называемый, "полупрямой" путь, который включает в себя антигенпрезентирующие клетки реципиента, распознающие донорские МНС-антигены через клеточные контакты «cell-to-cell» и активирующие Т-клетки-киллеры реципиента, обуславливающие хроническое отторжение [41]. В последнее время растет число свидетельств того, что B-клетки также играют важную роль в отторжении аллотрансплантата [104, 232], что соответствует полученным ранее экспериментальным данным о выраженной B-

23 23 клеточной инфильтрации отторгнутых аллотрансплантатов у лабораторных животных [56]. В отличие от Т-лимфоцитов, В-клетки могут распознавать антигены благодаря иммуноглобулиновым рецепторам, находящихся на поверхностной мембране в мономерной форме [177], контакт с которыми трансплантационных антигенов вызывает активацию В-лимфоцита, его пролиферацию и дифференцировку в антителообразующие клетки (АОК). Однако, полноценная активация B-клеток при трансплантации органов требует помощи других факторов, таких как белки комплемента, и CD4+ T- хелперные клетки [124, 112]. Секретируемые плазматическими клетками антитела могут реализовать свои функции либо участвуя в классическом пути активации системы комплемента, либо через комплементнезависимые механизмы. Так комплекс «антиген-антитело» является пуском активации белков системы комплемента с образованием в результате так называемого мембранатакующего комплекса (С5- С9), образующего поры в клеточной мембране с последующей гибелью клеткимишени [155; 181]. Альтернативу комплементзависимому повреждению клеток составляет антителозависимая клеточная цитотоксичность, где через специальные рецепторы (CD16) клетки-киллеры врожденного иммунитета (NK-клетки, нейтрофилы и макрофаги) взаимодействуют с антителами, покрывающими клетку-мишень и поражают ее [152, 124]. Одним из основных факторов, определяющих успешный исход трансплантации почки, является совместимость между донором и реципиентом генов лейкоцитарного антигена человека (HLA) основного комплекса гистосовместимости (MHC), в частности, антигенов II класса [51]. Сегодня считается общепризнанным тот факт, что присутствие в организме реципиента антител против клеточных антигенов, ему не свойственных (антидонорские антитела), обуславливает судьбу трансплантированного органа, в частности развитие посттрансплантационных отторжений более чем в 60% случаев. Сенсибилизация к чужим антигенам гистосовместимости может возникнуть после предшествующих трансплантаций, переливаний крови и беременностей [88].

24 24 Кроме того такие антитела, образующиеся против чужеродных HLA-антигенов донорской ткани, и поддерживающиеся Т-клеточным ответом в случае наличия клеток памяти, могут вызвать, гиперострое или острое отторжение органа на самом раннем этапе после трансплантации [168], тогда как при отсутствии соответствующей иммуносупрессии в более поздние сроки после трансплантации анти- HLA-антитела образуются de novo, что приводит к эпизодам острого или хронического антителоопосредованного отторжения трансплантата. Кроме того, смерть мозга донора трансплантируемой почки существенно увеличивает экспрессию MHC класса II и молекул адгезии (например, Е-селектина) [86], а это означает, что трансплантаты почек от доноров со смертью мозга отличает повышенная макрофагальная и Т-клеточная инфильтрация по сравнению с трансплантацией почек от живых родственных доноров [66]. Таким образом, при отсутствии анти-hla-антител и использовании эффективной Т-клеточной иммуносупрессии, эпизоды отторжения, в которых участвуют только Т-клетки при отсутствии антител, происходят достаточно редко и легко поддаются лечению [138]. При этом антителоопосредованные отторжения менее чувствительны к терапии и часто приводят к потере трансплантата, даже при субклинических вариантах отторжения [98]. В связи с этим, одной из основных целей тестирования гистосовместимости является точная идентификация HLA-антител реципиента к донорским антигенам до и после трансплантации с целью снижения иммунологического риска, а также для выявления и мониторинга продолжающегося отторжения [78]. У многих пациентов с поздней антителоопосредованной потерей трансплантата, даже с обнаруживаемыми аллоантителами HLA I класса, основными факторами, ответственными за процесс отторжения считаются образующиеся de novo циркулирующие HLA II класса (HLA-DR, - DP, - DQB и - DQA), которые чаще ассоциируются с трансплантационной гломерулопатией, вследствие их более высокой экспрессии на клетках эндотелия капилляров по сравнению с антигенами I класса HLA [190], тем самым повышают риск потери трансплантата на поздней стадии трансплантации [17, 81].

25 25 Однако сегодня известно, что неблагоприятные прогнозы трансплантации донорских органов не ограничиваются антигенной системой HLA и аллогенные антитела могут также генерироваться против других антигенных систем, отличных от HLA. В этом отношении хорошо известна негативная роль антител против альфа-цепи МНС I класса, против рецепторов 1 типа к ангиотензину-ii и рецепторов к эндотелину-1 [75, 33, 176, 60]. Сегодня также известно, что патогенетически значимы не только антитела класса IgG, но и наличие донорских антител класса IgM может обуславливать неблагоприятный посттранслантационный прогноз [198]. Таким образом, если обнаружение у реципиента донорских антител могло служить противопоказанием для трансплантации, то в настоящее время их появление de novo после трансплантации также связывают с неблагоприятным исходом трансплантации. Кроме того важна и концентрация донорских антител, поскольку известно, что у пациентов с очень низкими их уровнями пострансплантационный период может пройти весьма благополучно [69, 166]. Таким образом, в основе острого и хронического отторжения трансплантата лежат сложные иммунологические механизмы, включающие реакции как гуморального, так и клеточного иммунитета, основывающиеся на иммунологическом распознавании донорских антигенов гистосовместимости. 1.3 Лабораторные критерии диагностики отторжения почки Трансплантация почки предоставляет пациентам с почечной недостаточностью наилучшую возможность жить дольше и полноценнее, однако иммуносупрессивная терапия, необходимая в посттрансплантационном периоде, не предотвращает полностью острые или субклинические эпизоды отторжения трансплантата или его функциональной недостаточности [239]. В этой связи весьма актуальным вопросом является разработка стратегий мониторинга, в том числе, иммунных рисков отторжения, потери трансплантата и осложнений, связанных с трансплантацией.

26 26 Традиционный мониторинг пациентов с трансплантацией почки состоит в оценке изменений уровня креатинина в сыворотке крови, а также других лабораторных показателей, отражающих протеинурию, лекарственный мониторинг иммуносупрессивных препаратов, а также исследование почечных биоптатов, которое считается золотым стандартом в оценке отторжения трансплантата [187]. Тем не менее, эти диагностические подходы не лишены недостатков: повышение уровня креатинина в сыворотке крови в ответ на отторжение происходит достаточно поздно, а значит, исключает возможность использования данного показателя для выявления острого отторжения в превентивном порядке при состоянии субклинического отторжения. Кроме того, сывороточный уровень креатинина не способен предсказать или оценить прогрессирование хронического отторжения почки и, как следствие, не является специфическим или прогнозирующим [193]. Биопсия почечного трансплантата так же не может использоваться для мониторинга прогрессирования отторжения, поскольку она инвазивна и не может быть выполнена серийно; существуют проблемы и возможные отклонения в качестве образца ткани; процедура биопсии не исключает осложнений, а, кроме того, прогностическая значимость биопсии почечного трансплантата явно недостаточна. В частности, установлено, что у 60% пациентов с высокой активацией эндотелия и с хроническим антителоопосредованным отторжением почечных трансплантатов гистологические исследования не обнаруживают Cd4-компонент комплемента в перитубулярных капиллярах [195]. Это указывает на низкую чувствительность гистологических исследований биоптата для диагностики гуморальных отторжений и обосновывает поиск новых биомаркеров воспаления и повреждения эндотелиальных капилляров, в том числе, связанных с функциями клеток врожденного иммунитета (NK, моноцитов\макрофагов) [123, 152]. Между тем мнения на этот счет весьма разноречивы известны данные о том, что обнаружение в биоптатах С4d и С3d фрагментов комплемента, ассоцииациировано с донорспецифическим антителами и дисфункцией аллотрансплантата при остром отторжениии [98].

27 27 Очевидно, что разработка неинвазивных надежных и прогностических биомаркеров для ранней диагностики и мониторинга любого клинического состояния после трансплантации почки имеет важное значение для индивидуализированного лечения [135]. Многие трансплантационные центры определяют донорспецифические аллоантитела (DSA). Они являются маркерами иммунного ответа на донорские антигены и традиционно рассматривается как поздние и угрожающие жизни маркеры отторжения, которые трудно нейтрализовать [72]. Многие центры классифицируют пациентов в зависимости от степени иммунологического риска, основанного главным образом на наличии или отсутствии (или титрах) предсуществующих анти-hla-антител [40] (больший риск, если DSA) и результатов кросс-матч теста. Таким образом, пациент с отрицательным кросс-матчем и отсутствием анти-hla-антител может иметь низкий иммунологический риск даже при высокой степени несоответствия HLA. Однако, этот тип классификации, основанный на присутствии предварительно сформированных аллоантител, представляет риск в первую очередь для немедленного отторжения или раннего гуморального отторжения (ABMR) [139]. Но пациенты с трансплантацией почки обычно имеют комбинацию иммунологических факторов, которые подвергают их риску для обоих типов отторжения [186], поэтому рекомендации и предложения должны быть адаптированы к конкретным клиническим и иммунологическим характеристикам конкретных пациентов, что позволит обеспечить более персонализированный терапевтический подход [219]. В рамках пересмотра классификации Banff (классификация патологии почечного трансплантата) в 2017 году в качестве потенциального диагностического критерия острого отторжения трансплантата была предложена оценка молекулярных маркеров, указывающих на эндотелиальное повреждение при биопсии почечного аллотрансплантата, однако единого мнения о том какие маркеры являются диагностическими, и какие критерии считать позитивными, пока не достигнуто.

28 28 В последние годы активно обсуждаются вопросы диагностики антителоопосредованного отторжения (AВMR), Т-клеточного отторжения (TCMR) и смешанного отторжения в почечных аллотрансплантатах [139]. Накапливающиеся данные подтверждают концепцию о том, что не все донорспецифические антитела (DSA) равнозначны по своей диагностической значимости и не все DSA обладают способностью связывать комплемент или подклассы IgG. Актуальным на сегодняшний день является то, что не только конкретные донорские анти-нlа-антитела участвуют в гуморальном отторжении трансплантата (AВMR). Антитела против других молекул [208], а также полиреактивные антитела, направленные против апоптотических клеток так же могут вызвать AВMR [172]. Многими исследователями сегодня поддержано мнение о том, что молекулярная трансплантационная диагностика находится на том этапе, когда ее можно перевести в клинически значимые и применимые диагностические инструменты, однако существуют значимые препятствия, которые необходимо преодолеть [137, 100]. Таковыми, в частности, являются следующие сложности: 1) отсутствие истинного диагностического золотого стандарта, с которым можно сравнить и откалибровать новую молекулярную диагностику (золотой стандарт для серологии или гистологии также отсутствует); 2) результаты исследований были получены, как правило, при использовании гетерогенных когорт обследуемых с диагностическими критериями различных интерпретаций классификации Banff; 3) отсутствие завершенных проспективных, контролируемых, рандомизированных и валидированных исследований; 4) отсутствие единого мнения и согласия по оцениваемым биомаркерам эндотелиального повреждения, выявленных при изучении биоптата почечного аллотрансплантата. Так же ведется много споров о том, какой биоматериал наиболее предпочтителен для исследования маркеров отторжения. Так например, некоторые авторы считают, что при трансплантации почки моча является

29 29 наиболее привлекательным материалом для неинвазивного тестирования и обнаружения биомаркеров, и на сегодня уже найдены некоторые весьма перспективные биомаркеры мочи. В частности, иммуноферментная оценка в моче хемокинов CXCL10 и CXCL9 свидетельствует об их существенном повышении в период острого отторжения, и, что особенно важно, об их снижении при лечении, что указывает на их диагностическую и прогностичекую значимость [105]. Наряду с этим высокие уровни в моче конечных продуктов цитотоксических реакций (перфорина и гранзима B) обнаруживают только у пациентов с отторжением в отличие от лиц с благоприятным посттрансплантационным периодом [214]. Между тем тот факт, что почка пропускает в мочу не все сывороточные молекулы, высвобождаемые клетками в процессе иммунных реакций или поврежденными паренхиматозными клетками, многие из этих молекул не являются надежными маркерами отторжения и еще менее надежны в качестве маркеров толерантности. Оценка концентрации шести цитокинов в моче человека (IL-2, IL-4, IL-5, IL- 10, TNF-α и INF-γ) показала, что у пациентов, у которых развилось отторжение аллотрансплантата почки, наблюдались высокие уровни цитокинов IL-10 и IFN-γ в моче по сравнению с пациентами без отторжения [111]. Исследование концентрации моноцитарного хемоаттрактанта (MCP-1) в моче и сыворотке крови пациентов с трансплантацией почек, проведенные под руководством ВОЗ установили увеличение его экскреции с мочой в 10 раз при отторжении трансплантата почки на протяжении 6 месяцев после трансплантации [173, 76]. Ингибитор миграции макрофагов (MIF) является провоспалительным цитокином и мощным активатором макрофагов и Т-клеток и выявление его в моче у пациентов с аллотрансплантатами в течение первых 14 дней после трансплантации продемонстрировало резкое повышение MIF уже на 1-й день после трансплантации до эпизодов острого отторжения [52]. Традиционные и новые комбинации биомаркеров, включая биомаркеры фильтрации и повреждения, могут быть использованы в диагностике отторжения

30 30 трансплантата. В последнее десятилетие в качестве нового метода ранней диагностики острого отторжения трансплантата почки предложено определение в сыворотке крови цистатина-с, который во многом превосходит такой биомаркер состояния клубочковой фильтрации, как креатинин, но до сих пор не имеет широко распространенных рекомендаций по его применению в диагностике острого отторжения почки [68, 231, 67]. Однако, результаты исследований J.F. Roos (2007) свидетельствуют о сходстве этих двух биомаркеров по диагностической значимости, тогда как в другом систематическом обзоре, проведенном Z. Zhang (2011) показано, что сывороточный уровень цистатина-с является подходящим биомаркером крови для диагностики острого отторжения, тогда как концентрация его в моче имеет умеренное диагностическое значение [233]. По результатам многих исследований, отображенных в аналитическом обзоре Y. Feng (2014), повышение уровня цистатина-с связано с повышенным риском летальности и необходимостью проведения диализа в 5-летнем наблюдении у пациентов с острым отторжением почечного трансплантата [82]. Несмотря на имеющиеся различия в диагностической значимости цистатина-с, тот факт, что его уровень в сыворотке крови повышается в течение первых 24 часов после развития острого отторжения у пациентов, позволяет этому биомаркеру быть подходящей альтернативой традиционным диагностическим тестам [156]. Кроме того липокалин, ассоциированный с нейтрофильной желатиназой (NGAL), молекула повреждения почек-1 (KIM-1) и белок связывания жирных кислот печени (L-FABP), а также такие традиционные биомаркеры, как микроальбумин мочи и фракционная экскреция натрия, также помогают диагностировать острое отторжение почечного трансплантата [1, 35]. В результате проведенного проспективного анлиза было показано, что средний уровень NGAL мочи (ungal) значительно выше только у пациентов, с развивающиейся дисфункцией трансплантата [87; 106]. У пациентов с высоким уровнем донорского ungal ( 18 нг/мл) отсроченная функция трансплантата наблюдалась 14 дней и происходила чаще, чем у пациентов с низким значением

31 31 донорского ungal (<18 нг/мл), то есть уровень ungal был независимым фактором риска для отсроченной функции трансплантата, но не может ее прогнозировать [175]. Однко, если ukim-1 и ul-fabp у доноров связаны с почечным повреждением у самого донора, то ungal ассоциирован с дисфункцией непосредственно трансплантата. Кроме того, как ungal, так и ul- FABP коррелируют с 6-месячным уровнем сывороточного креатинина, но только у реципиентов без нарушения функции трансплантата [121]. 1.4 Диагностическая роль цитокинов в реакциях отторжения трансплантата Важнейшими медиаторами воспаления, участвующими в развитии аллоиммунного ответа, приводящего к отторжению трансплантата, являются цитокины [65], которые можно классифицировать на две основные группы: цитокины Th1-типа (IL-2, IFN-γ, TNF-α), опосредующие клеточный иммунный ответ, и цитокины Th2-типа (IL-4, IL-5, IL-10), опосредующие гуморальный иммунный ответ [164]. Считается, что Th1-цитокины ассоциированы с развитием реакции отторжения трансплантата, а Th2-с индукцией иммунологической толерантности [26], хотя некоторые экспериментальные данные свидетельствуют и о роли Th2-цитокинов в остром почечном отторжении [111]. По этой причине лабораторная оценка цитокинов представляет значимый практический интерес, поскольку эти белки широко используются в качестве биомаркеров для понимания и прогнозирования прогрессирования заболевания и мониторинга эффектов лечения [201]. Тканевый стресс, развивающийся в головном мозге после смерти донора, приводит к эндотелиальной дисфункции и к высвобождению хемокинов, а ишемически/реперфузионное повреждение к высвобождению из погибших клеток в результате окислительного повреждения активных форм кислорода, усиливающих продукцию провоспалительных цитокинов.

32 32 В частности, известно, что в патогенезе отсроченной функции трансплантата, центральную роль играют Th1 [140], и связанный с ними IL-12, что подтверждается некоторыми исследованиями, демонстрирующими корреляцию между повышенными уровнями IL-12 как до, так и после трансплантации с развитием острого отторжения [84]. Недавними исследованиями генотипа и частот аллелей полиморфизмов генов цитокинов у реципиентов почки выявлена ассоциация между носителями генотипа АА rs в IL12-B и отсроченной функцией трансплантата [170]. Cегодня имеются убедительные доказательства того, что хемокины участвуют в органных поражениях, индуцированных воспалительных и иммунных реакциях после трансплантации [133]. Хемокины влияют на иммунную клеточную миграцию, являясь хемоаттрактантами, действуя в четырех основных направлениях [36]: 1) привлечение мононуклеарных клеток к месту воспаления; 2) индукция миграции антигенпрезентирующих клеток (АПК) в лимфатические узлы; 3) участие во взаимодействии T-клеток и АПК в лимфоузлах; 4) усиление миграции аллореактивных Т-лимфоцитов в трансплантат. В частности, при реперфузии вырабатываются провоспалительные цитокины, (TNF-α, IL-1β), которые, в свою очередь стимулируют высвобождение хемокинов из эндоваскулярного эндотелия (CCL2 и CXCL8), усиливающих миграцию фагоцитов (моноцитов\макрофагов и нейтрофилов) в трансплантат. Наряду с этим после реперфузии быстро увеличивается концентрация IFN-γиндуцируемых хемокинов (CXCL9, CXCL10 и CXCL11), также участвующих в отторжении трансплантата [61]. Эпителиальные клетки почек обладают выраженной способностью продуцировать хемокины [12], привлекающие лимфоциты и вызывающие воспаление при отторжении на ранних этапах, тогда как на более поздних стадиях отторжения трансплантата, характеризующихся артериосклерозом и фиброзом, концентрация хемокинов еще более увеличивается [37]. Это свидетельствует о

33 33 том, что уровни содержания хемокинов, например CXCL10, CXCL1, CXCL8 и лиганды CXCR2, могут представлять интерес в качестве биомаркеров для мониторинга воспаления в трансплантате и прогнозирования фиброза печени. Известно, в частности, что для ранней фазы острого отторжения характерно увеличение концентрации CCL2 (моноцитарный хемотаксический пептид-1, MCP-1), тогда как M-CSF, CCL5 и VEGF значительно возрастают на 7-й день после трансплантации [131]. CCL2 является специфическим и мощным хемоаттрактантом и активирующим фактором для моноцитов и макрофагов, экспрессия гена которого строго коррелирует с моноцитарными инфильтратами и тубулоинтерстициальным повреждением при острых и хронических нефритах [94]. M-CSF считается фактором выживания, пролиферации и дифференцирования моноцитов и макрофагов и играет важную роль в производстве цитокинов, необходимых для цитотоксической и фагоцитарной функции моноцитов\макрофагов [85]. В экспериментах на лабораторных моделях отторжения транслантата выявлена усиленная экспрессия M-CSF и макрофагальная инфильтрация отторгнутых аллотрансплантатов [125]. Однако вопрос о том, может ли определение сывороточной концентрации M-CSF дифференцировать острое отторжение от других причин нарушения функции аллотрансплантата у человека остается нерешенным. Фактор роста гепатоцитов (HGF) играет большую роль в регенерации не только печени, но и почек и только у пациентов с острым отторжением почечного трансплантата HGF был заметно повышен, что сопровождалось увеличением сывороточного креатинина и азота мочевины [206]. Повышенная экспрессия мрнк VEGF эндотелиально-специфического фактора роста, способствующего пролиферации, дифференцировке и выживанию эндотелиальных клеток, наблюдалась в аллотрансплантатах лабораторных крыс, главным образом при хроническом отторжении, как фактор воспаления и фиброза [179], где она может иметь важное значение при воспалении и развитии фиброза. C иммунологической точки зрения важным предтрансплантационным

34 34 предвестником дисфункции трансплантата можно считать рецептор 2 фактора некроза опухоли (TNFR-2), экспресируемый циркулирующими Т-регуляторными клетками [159], а также растворимая форма CD30 (scd30) гликопротеин, экспрессированный на клетках CD4+CD8+ T-клетках человека, которые способны генерировать аллоиммунный ответ против трансплантированной почки и поэтому scd30 является предиктором неблагоприятного результата трансплантации [174, 191]. Сегодня перспективно изучение цитокинового профиля у пациентов до трансплантации с целью поиска биомаркеров возможного развития острого отторжения, причем неинвазивными методами, например в моче. В частности, за 1 день до трансплантации образцы мочи пациентов были протестированы на концентрацию Th1/Th2 цитокинов (IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IFN-γ и TNF-α), в результате чего были обнаружены повышенные концентрации IL-10, IFN-γ и TNF-α в моче у больных с развившимся впоследствии острым отторжением [113]. Более высокие уровни провоспалительных цитокинов ИФН-γ и ФНО-α (но не IL- 2) в этой группе больных до трансплантации могут свидетельствовать об интенсивном аллоиммунном Th1-ответе, приводящем к острому отторжению почечного трансплантата на ранней стадии послеоперационного периода, что согласуется с данными A. Amirzargar с соавторами (2005) о повышенной концентрации IL-10 в моче больных с острым отторжением почки вследствие активации моноцитов/макрофагов [26]. Полученные данные свидетельствуют о том, что высокие концентрации IL-10, IFN-γ и TNF-α в моче пациентов с посттрансплантационным осложнением до трансплантации почки можно рассматривать как факторы риска, повышающие вероятность острых эпизодов отторжения. Резюмируя изложенное, следует заключить, что растущие знания о глубине и характере изменений в организме, протекающих после трансплантации аллогенного трансплантируемого органа ведут к осознанию необходимости глубоких изменений и в спектре клинической диагностики отторжения аллотрансплантата. Наблюдаемые сегодня виды отторжения более сложны, чем

35 35 раньше, причем классическая картина отторжения заменена более тонкими или медленно развивающимися формами, которые не распознаются обычными тестами, используемыми для контроля функции трансплантата [138]. При этом низкая чувствительность и другие ограничения традиционных диагностических систем возможно устранить только разработкой новых методов, позволяющих точнее оценить диагноз, активность и стадию процесса, а также его прогноз на основе молекулярно-биологических измерений. Наиболее перспективным среди новых методов можно считать метод мультиплексного анализа, позволяющий в короткие сроки получить информацию о большом числе параметров [101]. Прогнозирование риска острого отторжения необходимо для предотвращения развития отдаленных иммунологических осложнений и недостаточности трансплантата после трансплантации почки. Помимо анализов, используемых для определения антител к антигенам HLA, применяются также активационные биомаркеры иммунных клеток и тесты, оценивающие клеточные иммунные реакции, среди которых наиболее ценны те, которые являются предикторами возможного осложнения, а таковых, к сожалению, недостаточно. Примером могут служить данные о том, что у пациентов с повышенным числом донорских ИФН-γ-секретирующих клеток перед трансплантацией повышается риск отторжения и ухудшается функция трансплантата [108; 117], а также факт существования корреляции между количеством клеток, секретирующих ИФН-γ до трансплантации, и количеством несоответствий I класса HLA между пациентами и их соответствующими донорами почек [62]. Таким образом, в настоящее время наступает период осознания неоспоримой важности цитокинов, оценка содержания которых в биологических жидкостях и изучение их продукции клетками может оказать неоценимую помощь для характеристики состояния иммунной системы организма в таких ситуациях, как посттрансплантационные осложнения, особенно, при изучении их протективной роли, то есть при оценке сывороточного их содержания у пациента перед трансплантацией.

36 36 Глава 2. Материалы и методы исследования Диссертационное исследование проводилось на кафедре клинической иммунологии, аллергологии и клинической лабораторной диагностики ФПК и ППС ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России (г. Краснодар) и в лаборатории Краснодарского краевого координационного центра органного донорства «Научно-исследовательского института Краевая Клиническая больница 1 имени профессора С.В. Очаповского» Минздрава Краснодарского края (г. Краснодар). 2.1 Объект исследования Объектом исследования явилась периферическая кровь 58 реципиентов аллогенной почки диализного отделения «ГБУЗ НИИ-ККБ 1» г. Краснодара, которым была выполнена трансплантация за период с января 2015 года по август 2016 года, а также 20 здоровых доноров крови в возрасте от 18 до 70 лет. Критерии включения пациентов в исследование: 1. Возраст от 18 до 70 лет; 2. Клинически и лабораторно подтвержденный диагноз: хроническая болезнь почек (ХБП); 3. Информированное согласие пациентов, а также здоровых доноров на исследование иммунологических параметров; 4. Трансплантация органа, выполненная в данном лечебном учреждении; 5. Отсутствие предсуществующих HLA-антител на момент трансплантации. Критерии исключения пациентов из исследования: 1. Возраст младше 18 и старше 70 лет; 2. Наличие острых и хронических внепочечных инфекционновоспалительных заболеваний; 3. Наличие предсуществующих HLA-антител на момент трансплантации. 4. Отказ пациентов от участия в исследовании.

37 37 На основании результатов анализа медицинских карт было сформировано три основных клинических группы (таблица 2.1.1) и группа условно здоровых лиц (4 группа). Таблица Характеристика клинических групп обследуемых Характеристики Группа 1 Группа 2 Группа 3 Отсутствие острого отторжения почки Острое отторжение почки Отсутствие HLA-антител Наличие HLA-антител Отсутствие HLA-антител на момент отторжения Количество пациентов в группе 43 (74,1%) 7(12,1%) 8(13,8%) Распределение пациентов по полу Мужчин Женщин 26 (60,5%) 17 (39,5%) 4 (57,2%) 3(42,8%) 7 (87,5%) 1 (12,5%) Распределение пациентов по возрасту (4,7%) 7 (16,3%) 12 (27,8%) 8 (18,6%) 10 (23,3%) 4 (9,3%) - 1 (14,3%) 2 (28,6%) 4 (57,1%) (25%) 2 (25%) 4 (50%) - HLA-А HLA-В HLA-DR Несовпадения по HLA фенотипу 1,21±0,65 0,86±0,9 1,57±0,50 1,57±0,53 0,95±0,49 1,41±0,38 1,38±0,52 1,63±0,52 1,0±0 Хронический гломерулонефрт Аномалия развития мочеполовой системы Распределение по диагнозам 33 (76,7%) 5 (71,4%) 4 (50%) 3 (7%) - 2 (25%) Сахарный диабет 2 (4,7%) - 1 (12,5%) Прочие 5 (11,6%) 2 (28,6%) 1 (12,5%)

38 Базовая терапия (53,5%) 5 (71,4%) 20 (46,5%) 2 (28,6%) Такролимус Циклоспорин 38 3 (37,5%) 5 (62,5%) Характеристика клинических групп обследуемых: в группу 1 вошли 43 пациента обоего пола с неосложненным течением послеоперационного периода и с отсутствием в этот период в плазме HLAантител, группа 2 представлена 7 пациентами обоего пола с неосложненным течением послеоперационного периода, у которых были обнаружены в плазме HLA-антитела в период мониторинга после трансплантации, группа 3 включала 8 пациентов обоего пола с диагностированным острым отторжением трансплантата, подтвержденным иммуногистохимическим исследованием без образования HLA-антител на момент острого отторжения. группа 4 контрольная, представлена здоровыми лицами обоего пола в количестве 20 человек в возрасте от 18 до 70 лет (здоровые доноры станции переливания крови). Согласно данным таблицы из 58 пациентов мужчины составили 64% (n=37), а женщины 37% (n=21). При этом возраст пациентов группы 3 был от 31 года до 60 лет, группы 2 от 21 года до 50 лет, тогда как группа 1 была представлена всеми возрастными категориями в диапазоне от 20 до 67 лет. Самым значимым критерием подбора пар «донор-реципиент», является HLA-фенотип. Наибольшее количество несовпадений по фенотипу HLA антигенов I класса (HLA-А и HLA-В локусам) выявлено в 3 группе (1,38±0,52 и 1,63±0,52 соответственно), а по фенотипу HLA антигенов II класса (HLA-DR) во 2 группе (1,41±0,38). Наиболее распространенной причиной хронической болезни почек (ХБП) при обследовании данного контингента лиц во всех группах оказался

39 39 хронический гломерулонефрит (72,5%), тогда как поликистоз почек встречался в 8,6%, сахарный диабет в 5% случаев и 13,7% приходилось на другие заболевания, приводящие к поражению почек. Антитела в посттрансплантационный период регистрировались преимущественно к HLA антигенам II класса (у 6 человек) и лишь у одного реципиента к HLA антигенам I класса. Время появления антител составило у 2 человек через 30 дней, у 3 пациентов через 90 дней и у 2 пациентов через 150 дней после трансплантации (в среднем 90± 48,9). Среди основных клинических групп обследуемых только группа 3 включала пациентов с осложненным течением послеоперационного периода (острым отторжением) и с отсутствием HLA антител на момент отторжения трансплантата. Все отторжения были подтверждены иммуногистохимическим исследованием и классифицированы по международной классификации Banff. Следует отметить, что острое отторжение (у трех человек) наблюдалось через 30 дней после трансплантации, тогда как у остальных пациентов 3 группы лишь через дней (среднее время 157,5±52,5). Поскольку у пациентов с развившимся острым отторжением HLA-антитела выявлены не были, это соответствует данным о том, что не всегда появление антител неизбежно приводит к развитию отторжения [218]. Все пациенты с острым отторжением трансплантата получали стандартную терапию (кортикостероиды, иммуносупрессанты). Среди пациентов с неблагоприятным посттрансплантационным периодом у 50% (n=4) трансплантат был удален, у 37,5% (n=3) развилась хроническая трансплантационная нефропатия и летальный исход был зарегистрирован у 1 пациента (12,5%). В качестве нового подхода предтранспантационной диагностики был предложен метод иммунологического исследования уровня цитокинов в плазме крови у реципиентов почки за 6 часов до трансплантации и в различные сроки после трансплантации.

40 Дизайн исследования Концентрацию сывороточных цитокинов у пациентов с ХБП, относительно таковой условно здоровых лиц, определяли за 6 часов до трансплантации и в различные сроки послеоперационного периода (на 7 день, через 30, 90 и 180 дней) в соответствии с дизайном исследования (таблица 2.2.1). Таблица Дизайн исследования Условно Пациенты с ХБП (n=58) здоровые, (n=20) Анализ и идентификация предсуществующих HLA-антител HLA-генотипирование реципиентов и доноров для трансплантации солидных органов Тест комплемент-зависимой цитотоксичности (CDС) в парах «донор-реципиент» Определение в плазме концентрации цитокинов различных групп за 6 часов до трансплантации ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ПОЧКИ Определение концентрации в плазме цитокинов после трансплантации на 7 день через 30 дней через 90 дней через 180 дней Выявление de novo HLA-антител после трансплантации на 7 день через 30 дней через 90 дней через 180 дней Анализ, обработка и систематизация полученных данных Определение ранних прогностических критериев острого отторжения почечного трансплантата Определение биомаркеров характера течения послеоперационного периода Уточнение патогенетической значимости различных групп цитокинов в реакциях отторжения трансплантата

41 41 Всего было проанализировано 310 образцов по 47 цитокиновым параметрам. Взятие крови для исследования производили одновременно с плановым обследованием пациентов путем забора из локтевой вены 4 мл крови в вакуумные пробирки с ЭДТА в качестве антикоагулянта. В периферической крови пациентов всех клинических групп (1-3 группа) и условно здоровых пациентов (4 группа) выполнялось количественное определение следующих цитокиновых биомаркеров: 1) 21 интерлейкин IL-1a, IL-1b, IL-1RA,, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-15, IL-17A, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, IL-31, IL-33; 2) 2 интерферона IFN-α, IFN-ỵ; 3) 2 фактора некроза опухоли TNFα, TNF-β; 4) 10 хемокинов Eotaxin, GRO-α, IL-8(CXCL8), IP-10, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, MIG, SDF-1α, RANTES; 5) 12 факторов роста GM-CSF, NGF-β, BDNF, EGF, FGF-2, HGF, LIF, PDGF-BB, PIGF-1, SCF, VEGF-A, VEGF-D. 2.3 Методы иммунологических исследований Определение в плазме концентрации цитокиновых биомаркеров Определение в плазме концентрации цитокиновых биомаркеров проводилось с использованием технологии xmap на сформированной для этого исследования мультиплексной панели Simplex ProcartaPlex (ebioscience, США). Технология xmap объединяет принцип проточной цитометрии и применение флуоресцентно окрашенных частиц, нагруженных специфическими антителами (рисунок ).

42 42 Захват исследуемых аналитов Захватывающие микросферы Аналит Добавьте в подготовленный образец специфичные для исследуемого вещества захватывающие микросферы, покрытые специфичными для целевого вещества антителами Инкубируйте в течение 1-2 часов и промойте Детекторные антитела Инкубация / промывка Иммунный комплекс (сэндвич) Детектирование захваченного аналита Инкубируйте захваченные микросферами аналиты с биотинилированными специфичными для исследуемого вещества детекторными антителами Инкубируйте в течение 30 минут и промойте Инкубация / промывка Детектирование метки Для количественного определения исследуемого вещества инкубируйте с флуоресцентной меткой (SA-PE) Инкубируйте в течение 30 минут и промойте Считывание и анализ результатов Считывание результатов на анализаторе Luminex 100/200 или Magpix Анализ результатов Одновременное измерение выделенных аналитов посредством анализа по технологии ProcartaPlex Рисунок Последовательность выполнения иммунологического анализа по технологии ProcartaPlex

43 43 Принцип данного метода основан на построении калибровочного графика зависимости концентраций стандартов от флуоресцентного сигнала, для чего готовили серию 4-х кратных разведений стандартной смеси в количестве 7 стандартных образцов и использовали протокол для фильтрационного планшета. В 96-луночный планшет вносили по 50 мкл магнитных микросфер, покрытых антителами к каждому аналиту, после чего к микросферам добавляли по 25 мкл стандартных и контрольных растворов и исследуемых образцов плазмы крови, а также по 25 мкл универсального буфера, и инкубировали на шейкере со скоростью 500 оборотов в минуту при t24 о C в течение 30 мин, и на ровной поверхности при t4 о C в течение ночи (12 часов). Далее, после отмывки добавляли по 25 мкл смеси детекторных антител, и инкубировали при t24 о C в течение 30 мин, а после промывания лунок планшета в них добавляли по 50 мкл флоуресцентного красителя (стрептавидин-фикоэритрин) и инкубировали при t24 о C в течение 30 мин. На заключительном этапе в лунки вносили по 120 мкл буфера для считывания и инкубировали в течение 5 мин при t24 о C. Детекция результатов мультиплексного анализа выполнялась с использованием двухлазерной системы с цифровой обработкой сигналов на проточном флуоресцентном анализаторе Luminex 100/200 (Luminex Corporation, США) [50], а анализ результатов с использованием компьютерной программы ProcartaPlex Analist 1.0 (ebioscience, США) Анализ и идентификация HLA-антител На первом этапе исследования плазмы крови реципиентов почечных трансплантатов на HLA-антитела устанавливали наличие или отсутствие HLAантител к антигенам I и II класса при помощи набора реагентов LIFCODES LifeScreen Deluxe (Immucor Transplant Diagnostics, США) с применением проточного флуоресцентного анализатора Luminex (Luminex Corporation, США). Для этого в предварительно смоченные лунки фильтрационного планшета вносили по 40 мкл промывочного буфера комнатной температуры и 12,5 мкл

44 44 образца исследуемой плазмы, а так же положительный и отрицательный контроли. Затем добавляли по 40 мкл микросфер, нагруженных антигенами HLA I и II класса и инкубировали в термошейкере со скоростью 150 оборотов в минуту при t 24 o C в течение 30 мин. По окончании инкубации и трехкратного промывания лунок промывающим буфером вносили в каждую лунку по 50 мкл приготовленной заранее в микропробирке смеси 5 мкл коньюгата и 45 мкл промывающего буфера, инкубировали при тех же условиях и через 30 минут добавляли мкл промывающего буфера в каждую лунку, ресуспендировали микросферы пипетированием и проводили измерение при помощи анализатора Luminex (рисунок ). Рисунок Результат скрининга HLA-антител в программе анализатора Luminex

45 45 В случае обнаружения антител к одному или к обоим классам HLA, проводился тест на их идентификацию методом единичных антигенов реагентами LIFCODES LSA (Luminex Single Antigen) classi, LIFCODES LSA classii (Immucor Transplant Diagnostics, США). Метод основан на использовании микросфер, нагруженных очищенными рекомбинантными HLA-антигенами для определения антител, а так же рассчитывался индекс PRA% (панель реактивных антител). Индекс PRA% рассчитывается автоматически программным обеспечением, прилагаемым к наборам реагентов. Расчет базируется на основании профиля обнаруженных специфических антител и популяционной частоты встречаемости каждой специфичности антигена (рисунок ). Рисунок Результат идентификации HLA-антител в программе анализатора Luminex.

46 46 В предварительно смоченные лунки фильтрационного планшета вносили по 10 мкл образца плазмы крови, показавшей положительный результат в скрининге, а так же положительный и отрицательный контроли, 40 мкл промывающего буфера и по 5 мкл микросфер (для идентификации антител I класса LIFCODES LSA class I и для II класса LIFCODES LSA classii соответственно). Планшеты инкубировали в термошейкере со скоростью 150 оборотов в минуту при t 24 o C в течение 30 мин, а по окончании инкубации и трехкратного промывания лунок буфером вносили по 50 мкл коньюгата, приготовленного заранее путем смешивания в микропробирке 5 мкл коньюгата и 45 мкл промывающего буфера на каждую лунку и вновь инкубировали при тех же условиях, а через 30 минут добавляли мкл промывающего буфера в каждую лунку, ресуспендировали микросферы пипетированием и проводили измерение при помощи анализатора Luminex HLA-генотипирование реципиентов и доноров для трансплантации солидных органов HLA-генотипирование это метод определения генов тканевой совместимости. Для постановки этого метода использовались коммерческие наборы для молекулярно-генетического метода с использованием специфических праймеров SSP и SSO метода специфических зондов. Типирование доноров и реципиентов проводилось по локусам HLA-A, HLA-B, HLA-DRB1 системы HLA, низкого разрешения. На первом этапе осуществлялось выделение геномной ДНК пациентов из крови, взятой с антикоагулянтом на приборе автоматического выделения ДНК NorDiag Arrow (NorDiag, Норвегия). Перед проведением генотипирования проводили качественную и количественную оценку полученной пробы ДНК на сканирующем спектрофотометре Biowave DNA (Biochrom, Великобритания). Принцип действия

47 47 спектрофотометра основан на измерении значений оптической плотности жидкой биологической пробы и последующем пересчете, с помощью встроенных программ, полученного значения оптической плотности в концентрацию ДНК. Для оценки препаратов нуклеиновых кислот использовали соотношение поглощения оптической плотности 260/280 нм (ОП 260/280 нм) и 260/230 нм (ОП 260/230 нм) и фактор пересчета 50 для ДНК. Индикатором белкового загрязнения служит соотношение ОП на 260 и 280 нм. В чистых препаратах ДНК ОП 260/280 1,8. Перед измерением устанавливали оптический ноль по дистиллированной воде и проводили измерение 100 мкл препарата ДНК в оптической кювете с длинной оптического пути 100 мм с последующим автоматическим пересчетом концентрации ДНК в нг/мл. Генотипирование методом SSO выполняли на реагентах LifeCodes HLA- SSO HLA-A, LifeCodes HLA-SSO HLA-B, LifeCodes HLA-SSO HLA-DRB1 низкого разрешения (Immucor, США), с детекцией результата на анализаторе Luminex 100/200 (Luminex Corporation, США). На первом этапе доводили концентрацию ДНК до 15 нг/мл водой для ПЦР и готовили смеси для амплификации каждого локуса так, чтобы общий объем реакционной смеси составлял 20 мкл (таблица ). Таблица Приготовление ПЦР смеси для генотипирования методом SSO Реагенты Количество на каждую реакцию LifeCodes мастермикс 6 мкл Taq полимераза (5U/µl) 0,2 мкл ДНК в концентрации 15 нг/мл 6 мкл Вода для ПЦР 7,8 мкл В ПЦР-пробирки вносили готовые смеси и помещали их в амплифекатор для амплификации генетического материала с праймерами, меченными биотином по соответствующей программе (таблица ), продуктом которой явилась одноцепочечная нить ДНК с биотином.

48 48 Таблица Программа амплификации для HLA типирования методом SSO Этап Температура и время инкубации Количество циклов денатурация 95 о С, 3 мин 1 денатурация 95 о С, 15 сек 12 отжиг 60 о С, 30 сек элонгация 72 о С, 30 сек денатурация 95 о С, 10 сек 28 отжиг 63 о С, 30 сек элонгация 72 о С, 30 сек элонгация 72 о С, 2 мин 1 удержание 4 о С, 1 По окончании амплификации проводили этап гибридизации меченных продуктов амплификации с типирующими нуклеотидными последовательностями, нанесенными на микросферы, каждый тип которых на своей поверхности несет определенный фрагмент олигонуклеотида, соответствующий тому или иному полиморфному аллельному варианту HLAлокуса. Для этого в микропробирки для ПЦР вносили по 15 мкл микросфер и добавляли к ним по 5 мкл продукта амплификации. Такие смеси делали для каждого HLA-локуса (А, В и DRB1). Гибридизацию выполняли в амплификаторе (таблица ). Таблица Программа гибридизации Этап денатурация гибридизация удержание Температура и время инкубации 95 о С, 5 мин 47 о С, 30 мин 56 о С, 10 мин 56 о С, После окончания программы гибридизации, в режиме удержания при 56 о С, не вынимая микропробирок из амплификатора, добавляли раствор коньюгата

49 49 стрептовидин-фикоэритрина в разведении 1:200 в каждую пробу и переходили к этапу считывания результата в анализаторе Luminex. По окончании измерения, данные с Luminex перенесенные в программу интерпретации QuickType (в раздел «DNAanalysis»), где происходило суммирование данных с каждой микросферы и формировался отчет о генотипе (рисунок ). Генотипирование методом SSP выполняли на реагентах OLERUP SSP HLA TYPING KIT низкого разрешения (Olerup, Швеция), с детекцией результата в агарозном геле. Рисунок Отчет о генотипе программе QuickType анализатора Luminex. На первом этапе выделяли ДНК с концентрацией в диапазоне нг/мл и чистототой по коэффициенту А260/280 в пределах 1,6 2,0. Если концентрация ДНК оказывалась больше 50 нг/мл, то это могло привести к неспецифической

50 50 амплификации и тогда ДНК необходимо развести водой до нужной концентрации. Смесь для амплификации готовили согласно схеме (таблица ) так, чтобы общий объем реакционной смеси на лунку составлял 10 мкл. Таблица Приготовление ПЦР смеси для генотипирования методом SSР Реагенты Количество на каждую реакцию Мастермикс с Taq полимераза 312 мкл (5U/µl) ДНК в концентрации мкл нг/мл Вода для ПЦР 520 мкл Амплификация проводилась в 96- луночных планшетах, с внесенными в лунки лиофилизированным праймерами. Вносили готовые смеси в лунки ПЦРпланшета и далее помещали в амплификатор (AplyBiosistems, США), где выполнялась амплификация генетического материала с праймерами по программе (таблица ). Таблица Программа амплификации для HLA-генотипирования методом SSР Этап Температура и время инкубации Количество циклов денатурация 94 о С, 2 мин 1 денатурация 94 о С, 10 сек 10 отжиг и 65 о С, 60 сек элонгация денатурация 94 о С, 10 сек 20 отжиг 61 о С, 50 сек элонгация 72 о С, 30 сек удержание 4 о С, 1 Метод ПЦР-SSР основан на денатурации участков ДНК для получения одноцепочечных фрагментов и дальнейшего присоединения (отжига) праймеров к одноцепочечной ДНК-мишени. Для детекции результатов ПЦР проводили гель электрофорез полученных образцов. Для этого использовали 2% агарозный гель, в лунки которого вносили

51 51 готовый продукт. Далее гель помещали в камеру для проведения электрофореза «SE-2» (Хеликон, Россия) с TBE-буфером и бромистым этидием, который специфично взаимодействует с ДНК и флюоресцирует в УФ лучах. Форез проводили в течение минут при 8-10 Вт/см. При проведении электрофореза отрицательно заряженные фрагменты ДНК мигрируют в геле под воздействием электрического поля. Скорость движения фрагментов зависит от количества нуклеотидных пар в нем. Визуализация агарозных гелей осуществлялась в камере трансиллюминатора EX-20M (Vilber Lourmat, Франция), который излучает ультрафиолетовый свет в диапазоне нм, заставляющий флюоресцировать бромистый этидий в красно-оранжевом диапазоне. 2.4 Оценка перекрестной совместимости с помощью теста комплементзависимой цитототоксичности (CDC) Тесты перекрестной совместимости проводили перед трансплантацией с целью гарантировать отсутствие антительной сенсибилизации реципиента к антигенам донора. Для этого за 6 часов до трансплантации у доноров забирали 6 мл периферической крови в пробирку с 0,5 мл гепарина, а для выделения фракции лимфоцитов 3 мл стабилизированной крови, смешанной с 3 мл стерильного физиологического раствора наслаивали на градиент плотности Лимфолит с плотностью 1,077 г/мл (Gedarlane, Канада). По окончании центрифугирования пробирки (20 минут при 1500 об/мин.) кольцо лимфоцитов на границе градиента и плазмы крови собирали и переносили в чистую пробирку. После трехкратного отмывания клеток в физиологическом растворе их концентрацию доводили до клеток/мл и использовали в дальнейшем исследовании в тесте комплементзависимой цитототоксичности (CDC). С этой целью в 2-3 лунки планшета Терасаки вносили по 5 мкл образцов сыворотки потенциальных реципиентов, включая последний образец сыворотки и несколько «архивных» образцов, положительный и отрицательный контроли. Затем добавляли по 1 мкл взвеси лимфоцитов донора, покрывали минеральным маслом для предотвращения

52 52 испарения и инкубировали при комнатной температуре о С в течение 30 минут. Далее вносили по 5 мкл комплемента (Гисанс, Россия) и инкубировали при тех же условиях 60 мин. По истечении времени инкубации вносили по 5 мкл 5% водного раствора эозина для окрашивания клеток и через 10 минут визуально оценивали цитотоксическую реакцию с помощью инвертированного микроскопа Axio Observer (Zeiss, Германия). Оценка выраженности реакции осуществлялась по бальной шкале, в основу которой положена доля погибших клеток к их общему числу в лунке (с учетом фоновой гибели клеток в лунке с отрицательным контролем). При гибели 0-10% клеток реакция интерпретировалась как отрицательная, 10-30% - слабоположительная, 30-50% - положительная и % - выраженная положительная реакция. При этом учитывали, что положительная проба является противопоказанием для трансплантации. 2.5 Статистический анализ данных Статистическую обработку полученных данных выполняли с использованием статистической программы «Graph Pad Prism version 6.0» (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). При выборе методов статистической обработки данных исходили из типа данных и характера их распределения. Нормальность распределения количественных данных проводили с использованием критериев Шапиро-Уилка и Колмогорова-Смирнова. Критическое значение уровня статистической значимости при проверке нулевых гипотез принималось равным 0,05, то есть когда достигнутые уровни значимости превышали р>0,05, то принималась нулевая гипотеза [3]. Для описания данных использовалось среднее арифметическое и стандартное отклонение (M±SD). Сравнение групп пациентов по двум количественным переменным для малых выборок с ненормальным распределением проводили с помощью U-критерия Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при р 0,05.

53 53 Для оценки различий между рядами измерений, выполненных для одной и той же совокупности, но в разных условиях и в разное время использовали критерий Уилкоксона. Для изучения зависимости между переменными использовали корреляционный анализ. Силу взаимосвязи количественных переменных оценивали с помощью критерия корреляции Пирсона (r). Если r 0,75 корреляцию считали сильной, если r 0,25 слабой и 0,25 r 0,75 умеренной [11]. Для оценки различий между двумя и более группами совокупностей применялся метод дисперсионного анализа ANOVA, в частности для нормально распределенных количественных переменных применяли двухфакторный анализ Фридмана, а при сравнении совокупностей более двух, с ненормальным распределением использовали критерий Краскела-Уоллиса. Во всех случаях различия считали статистически значимыми при р 0,05.

54 54 Глава 3. Изучение предикторной роли цитокинов в мониторинге посттрансплантационных осложнений Современная концепция диагностики отторжения трансплантата основана на совершенствовании посттрансплантационных диагностических критериев Т- клеточного отторжения (TCMR), а так же на обновлении критериев оценки молекулярных особенностей, связанных с повреждением ткани, опосредованным антителами (ABMR) [97, 185]. Однако, молекулярные механизмы разрушения тканей при остром отторжении аллотрансплантата до конца не поняты, а исследования последних лет позволяют предполагать наличие общих механизмов повреждения тканей при различных по этиологии патологических процессах, включая реакции отторжения трансплантата [29, 197]. Приоритетные направления развития здравоохранения Российской Федерации, основанные на развитии индивидуальных подходов к пациенту повышают актуальность поиска новых биомаркеров-предикторов прогноза развития заболевания, оценки рисков осложнений, для более корректного выбора методов лечения и профилактики [13], послужили основанием для поиска таковых среди цитокинов различных классов. Основываясь на предположении о том, что определенные уровни содержания цитокинов в предоперационном периоде могут свидетельствовать о дисфункции трансплантата в послеоперационный период с возможным риском его отторжения, в плазме крови реципиентов с хронической болезнью почек (ХБП), за шесть часов до трансплантации методом мультиплексного анализа оценивали содержание 21 про- и противовоспалительного интерлейкина, 16 факторов роста, 11 хемокинов, а также 2 видов интерферонов и 2 видов фактора некроза опухоли. При этом в сводные таблицы результатов исследования не были включены те цитокины, уровень которых был равен нулю.

55 Оценка ассоциации предоперационного уровня про- и противовоспалительных интерлейкинов с выработкой анти-hla антител и развитием отторжения почки после трансплантации При анализе медиан выборок значения содержания интерлейкинов в плазме крови у пациентов с ХБП по сравнению с практически здоровыми лицами обращают на себя внимание изменения уровней как про-, так и противовоспалительных интерлейкинов, действующих в различных фазах иммунного ответа. Разнообразие изменений в содержании различных групп интерлейкинов у пациентов с ХБП свидетельствует о выраженности регуляторных нарушений иммунитета при данной патологии, что может обуславливать развитие острого отторжения трансплантируемой почки в послеоперационном периоде. Сравнительный анализ показал, что в группе с неосложненным течением послеоперационного периода (группа 1) установлено достоверное увеличение только трех интерлейкинов IL-12p70 (в 1,22 раза), IL-27 (в 40 раз) и IL-18 (в 2,63 раза) относительно здоровых лиц того же возраста, в то время как их уровень у пациентов 2-й группы (наличие HLA-антител при неосложненном посттрансплантационном периоде) был выше в 1,45, 185 и в 3,49 раза, соответственно (таблица 3.1.1). Полученные в исследовании данные, а также известные сведения о том, что провоспалительный цитокин IL-12p70 усиливает реакции Th1-клеток, цитотоксических CD8+ Т-лимфоцитов и цитотоксических NK-клеток путем увеличения продуцирования IFN-γ [14], но при этом является важнейшим цитокином для генерации и стимуляции функций Treg, подавляющих отторжение аллотрансплантата [215]. Это позволяет считать, что исходный повышенный уровень IL-12p70 является показателем благоприятного течения посттасплантационного периода. Вместе с тем во 2-й группе пациентов наблюдалось трехкратное повышение плазменной концентрации IL-1β и 15-ти кратный подъем уровня IL-6.

56 Таблица Концентрация провоспалительных интерлейкинов в сыворотке крови пациентов с ХПБ перед трансплантацией почки (Мe [Q1 Q3]) 56 Группа/ интер Группа 1 (n=43) Группа 2 (n=7) Группа 3 (n=8) Группа 4 (n=20) лейкины, Отсутствие острого отторжения Острое пг/мл отторжение Контроль Отсутствие HLA-антител Наличие HLA-антител Отсутствие HLA-антител на момент отторжения (здоровые доноры СПК) 0 [0; 0] 2,86 1,09 0 [0; 0] IL-1β p>0,05 [1,83; 5,03] p=0,002**^ [0,55; 1,32] p=0,002** 0,99 15,58 22,8 0 [0; 0] IL-6 [0; 13,59] р>0,05 [12,55; 46,16] p=0,009**^ [15,60; 49,14] p=0,009**^ IL-12p70 4,88 [4,59; 5,22] 5,79 [5,61; 7,82] 4,91 [4,82; 5,20] 4,0 [3,74; 4,10] p=0,01* p=0,02* p<0,05 40, ,51 0 [0-0] IL-27 [21,12; 64,41] p=0,002**^ [91,85; 202,6] p=0,04* [68,94; 129,49] p=0,004** 0 [0; 1,7] 0 [0; 0] 2,09 0 [0; 0] IL-17А p>0,05 p>0,05 [1,05; 3,78] р=0,04*^ IL ,65 [72,9; 288,7] р=0,03* 187,15 [186,13; 650,89] р<0,0001***^ 88,88 [85,73; 129,15] p=0,009* 53,04 [36,63; 59,4] Примечание: *- р<0,05, **-р<0,01,***-р<0,001-достоверность отличий от контроля; ^-достоверность межгрупповых различий Между тем у пациентов с развившимся в дальнейшем острым отторжением почки (группа 3), наблюдалось повышение уровня всех провоспалительных интерлейкинов. Так в данной клинической группе обнаружено значительное (в 23 раза) повышение содержания IL-6, а так же IL-17А в два раза выше физиологической возрастной нормы. Известно, что IL-17А стимулирует продукцию макрофагами IL-6, TNFα, а так же вовлечен в воспалительные механизмы и повреждения трансплантата на

57 57 раннем посттрансплатационном этапе [130], а его дефицит или блокада анти-il- 17А-антителами способствует благоприятному течению послеоперационного периода и выживаемости трансплантата [226]. Это может свидетельствовать о том, что предтрансплантационная оценка IL6 и IL17А имеет важное прогностическое значение, как предиктор развития реакции отторжения трансплантата. Наряду с возрастанием концентрации ряда провоспалительных интерлейкинов при анализе данных выявлено снижение некоторых их видов. В частности, содержание в крови провоспалительных IL-1β, IL-27 и IL-18 было значительно ниже (Таблица 3.1.2), чем у пациентов с благоприятным течением посттрасплантационного периода и наличием HLA-антител (2-я клиническая группа). Это соответствует ранее полученным сведениям о том, что высокий уровень концентрации IL-18 в моче через 24 часа после трансплантации считается ранним биомаркером плохой выживаемости трансплантата [99, 150]. При оценке у пациентов перед трансплантацией почки противоспалительных цитокинов обнаружено значительное возрастание IL-1RA во всех клинических группах относительно контроля, но наиболее выраженное увеличение (в 13 раз) наблюдалось только в 3-й клинической группе, у пациентов которой в послеоперационный период развилось отторжение трансплантируемой почки, что позволяет считать данный противовоспалительный цитокин прогностически значимым критерием неблагоприятного послеоперационного периода для реципиентов трансплантируемой почки при ХБП. Известно, что противовоспалительные цитокины IL-4 и IL-13 относятся к Th2-цитокинам, контролирующим функциональную активность макрофагов (M2), экспрессию MHC-II, дифференцировку В-клеток в плазматические клетки [145], а также способны ограничить de novo Th1/17-ответ и замедлить прогрессирование заболевания [213; 129].

58 Таблица Концентрация противоспалительных интерлейкинов в плазме крови пациентов с ХПБ перед трансплантацией почки (Мe [Q1 Q3]) Группа/ интер Группа 1 (n=43) Группа 2 (n=7) Группа 3 (n=8) Группа 4 (n=20) лейкины, пг/мл Отсутствие острого отторжения Острое отторжение Контроль (здоровые Отсутствие HLA-антител Наличие HLA-антител Отсутствие HLA-антител доноры СПК) IL-1RA 447,34 [359,16; 639,83] p=0,002** 345,08 [286,85; 363,92] р=0,02* 1045,22 [805,24; 1320,15] p=0,005**^ 81,04 [6,68; 208,16] IL-4 19,70 [13,12; 39,46] р>0,05 43,89 [21,95; 75,27] р=0,04* 34,70 [26,13; 35,96] p=0,02*^ 11,32 [8,12; 14,78] IL-13 2,69 [2,21; 3,17] р=0,01* 7,08 [4,34; 10,42] р=0,02* 3,84 [2,84; 4,37] р=0,01* 1,64 [1,07; 1,99] Примечание: *- р<0,05, **-р<0,01,***-р<0,001-достоверность отличий от контроля; ^-достоверность межгрупповых различий 58 В этой связи интерес представляют полученные данные о том, что во всех клинических группах их содержание достоверно превышало контрольные значения, однако максимально высокие значения, как маркеры появления HLAантител при благоприятном периоде после трансплантации почки были отмечены во 2-й клинической группе (в 3,87 и в 4,31 раза, соответственно), а наименьшее их возрастание наблюдалось в 1-й клинической группе обследуемых, отличающихся отсутствием HLA-антител в благоприятном периоде после трансплантации (таблица 3.1.2). Корреляционный анализ так же подтвердил сильную взаимосвязь между IL- 4 и IL-13 во всех клинических группах. В частности, для 1-й группы коэффициент Пирсона (r) составил 0,949 (p= 0,004), для 2-й группы 0,993 (p < 0,0001) и для 3-й группы 0,894 (p=0,016). Оценивая в целом результаты исследования про- и противовоспалительных интерлейкинов реципиентов с ХБП накануне трансплантации аллогенной почки, следует заключить, что достоверным предиктором острого отторжения с высокой

59 59 степенью вероятности можно считать только возрастание провоспалительного IL- 17А и IL-1RA, поскольку концентрации этих биомаркеров имели статистически значимые отличия от таковых в группах 1 и 2 в плазме крови за 6 часов до трансплантации, а также здоровых лиц. Остальные про- и противовоспалительные цитокины, по-видимому, следует рассматривать как показатели клинической тяжести ХБП и риска отторжения почки, при котором их изменения имели большую степень выраженности. В частности, речь идет о наиболее выраженном возрастании провоспалительного IL-6 в 3 группе пациентов с ХБП, тогда как критериями благоприятного исхода трансплантации почки (без развития отторжения и образования HLA-антител) следует считать отсутствие или крайне низкий уровень провоспалительных IL-1β, IL-6 IL-17А. 3.2 Оценка ассоциации предоперационного уровня факторов роста с выработкой анти-hla антител и развитием отторжения почки после трансплантации В настоящее время результатами многих исследований доказано, что факторы роста посредством взаимодействия с соответствующими трансмембранными рецепторами, способны изменять внутриклеточный метаболизм, экспрессию генов и существенно влиять на скорость пролиферации или дифференцировки клеток [96]. В этой связи интерес представляла оценка групп факторов роста в плазме реципиентов почки за 6 часов до трансплантации, включающих гранулоцитарно-макрофагальный фактор (GM-CSF), фактор роста нервов (NGF-β), нейротрофический фактор мозга (BDNF), эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста гепатоцитов (HGF), фактор, ингибирующий лейкозные клетки (LIF), фактор роста тромбоцитов (PDGF-BB), фактор роста плаценты (PIGF-1), фактор роста стволовых клеток (SCF), факторы роста эндотелия сосудов (VEGF-A, VEGF-D), а также ряд интерлейкинов, которые можно рассматривать в качестве факторов роста иммунокомпетентных клеток (IL-2, IL-7, IL-15, IL-33).

60 60 Исследованиями показано значительное увеличение концентрации IL-2 у пациентов с ХБП накануне трансплантации почки, однако максимальное возрастание было характерно в группе реципиентов с последующим развитием реакции отторжения трансплантата (в 5,3 раза), тогда как у реципиентов 1 и 2 клинической группы было зарегистрировано увеличение концентрации IL-2 в 2,8 и 3,3 раза, соответственно. Сходное увеличение концентрации во всех клинических группах реципиентов с ХБП с максимумом в 3-й клинической группе выявлено в отношении IL-15: если в 1 и 2 группах с благоприятным течением послеоперационного периода имело место исходное возрастание концентрации данного интерлейкина в среднем в 2 раза, то в 3-й клинической группе реципиентов с последующим острым отторжением трансплантата наблюдалось его возрастание в 6,2 раза относительно возрастной нормы (таблица 3.2.1). Таблица Концентрация факторов роста в плазме крови у пациентов с ХБП перед трансплантацией почки (Мe [Q1;Q3]) Группа/ интер лейкины, пг/мл Группа 1 (n=43) Группа 2 (n=7) Группа 3 (n=8) Отсутствие острого отторжения Острое отторжение Отсутствие Наличие Отсутствие HLA-антител HLA-антител HLA-антител IL-2 22,69 26,63 43,50 [20,67; 32,80] [25,67; 28,91] [36,45; 45,02] р=0,04* р=0,03* p=0,005**^ IL-7 1,72 [1,35; 2,81] P=0,003**^ IL-15 15,52 [10,73; 30,77] p=0,03* IL-33 0,11 [0; 0,22] p>0,05 4,51 [4,0; 4,51] p>0,05 16,63 [12,08; 69,95] р=0,01* 0,22 [0,11; 0,40] p>0,05 3,41 [3,68; 3,96] p>0,05 44,83 [31,86; 86,36] p=0,002** 0,58 [0,58; 2,43] p=0,005**^ Группа 4 (n=20) Контроль (здоровые доноры СПК) 8,14 [0; 14,78] 6,46 [3,68; 9,56] 7,28 [1,10; 13,63] 0,22 [0,05; 0,49]

61 GM-CSF 13,52 [9,95; 22,82] р=0,03* 61 10,98 [9,58; 10,98] р=0,03* 20,71 [18,39; 22,89] P=0,005**^ 0[0; 0] NGF-β 0 [0; 0] 0 [0; 14,85] 0 [0; 4,27] 0 [0; 0] BDNF 236,69 [127,67; 320,47] p>0,05 EGF 15,45 [10,92; 20,97] p=0,005* HGF 255,15 [180,64; 268,87] p>0,05 LIF 0,35 [0; 0,98] PDGF- BB P=0,0002***^ 411,84 [387,22; 585,15] p>0,05 PIGF-1 35,31 [31,75; 44,95] p>0,05 SCF 66,71 [53,85; 70,64] P=0,0002*** VEGF-A 1169,50 [992,70; 1501,19] p=0,03* 116,44 [78,73; 373,54] p>0,05 20,98 [15,83; 27,00] p=0,01* 501,48 [347,44; 574,66] p>0,05 0,10 [0,05; 0,40] P=0,0002**^ 902,35 [660,88; 1303,51] р=0,03* 56,06 [37,85; 87,46] p>0,05 77,98 [71,88; 90,63] P=0,0002*** 1653,91 [1210,8; 1678,7] p=0,001*** 15,71 [12,99; 16,12] *^ 17,22 [13,10; 20,75] 409,68 [367,84;429,27] p>0,05 3,28 [2,36; 9,43] p>0,05 401,00 [314,58;414,27] p>0,05 34,79 [31,10; 38,28] p>0,05 44,42 [39,55; 59,66] P=0,0002*** 1013,43 [943,8; 1497,7] p=0,001*** 186,89 [63,03;363,73] 125,60 [8,15; 269,59] 212,65 [160,6;396,95] 3,35 [2,69; 6,05] 326,54 [154,1; 702,7] 79,57 [24,65;158,52] 8,70 [5,70; 11,09] 273,68 [183,5;498,75] VEGF-D 0[0; 2,29] p>0,05 0[0; 10,12] p>0,05 0[0; 2,25] p>0,05 Примечание: *- р<0,05, **-р<0,01,***-р<0,001-достоверность отличий от контроля; ^-достоверность межгрупповых различий 0 [0; 0] Еще одним предиктором острого отторжения трансплантата почки можно считать IL-33, концентрация которого в плазме накануне трансплантации была достоверно выше таковой у здоровых лиц (в 2,6 раза), тогда как в группах реципиентов с благоприятным течением послеоперационного периода значения данного интерлейкина входили в пределы физиологической нормы (таблица

62 ). Что же касается IL-7, то его достоверное изменение зарегистрировано только в 1 группе реципиентов, где имело место достоверное снижение показателя в 3,8 раза, тогда как в остальных клинических группах наблюдалась лишь тенденция к снижению (таблица 3.2.1). Сравнительный анализ GM-CSF при ХБП также продемонстрировал достоверное увеличение его плазменной концентрации во всех клинических группах с максимумом в 3 группе реципиентов с развившимся в последствие острым отторжением трансплантата почки (3 группа), тогда как в отношении BDNF отмечено исходное значительное снижение его уровня (в 12 раз относительно возрастной нормы) в группе с острым отторжением трансплантата (таблица 3.2.1). Прогностически значимый высокий уровень содержания гранулоцитарномакрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) в группе с острым отторжением трансплантата почки может быть обусловлен его способностью усиливать иммунный ответ реципиента посредством повышения активности молекул гистосовместимости HLA II класса, участвующих в представлении антигена после трансплантации органа [44]. Известно, что активность нейротрофического фактора роста (BDNF), принимающего участие в регуляции роста, развития, дифференцировки и выживания клеточных популяций и в процессах их адаптации к внешним воздействиям, достаточно высока не только в ЦНС (в гиппокампе, коре и в переднем мозге), но и в других, тканях, в частности, в почках [107]. В этой связи интерес представляют полученные нами данные о том, что только у пациентов с развившимся в последствии острым отторжением почки (3-я клиническая группа) уровень содержания BDNF в крови за 6 часов до трансплантации был в 12 раз ниже, чем у здоровых субъектов (р=0,007), тогда как в группах с благоприятным течением посттрансплантационного периода его уровень соответствовал таковому в контрольной группе (таблица 3.2.1). Между тем оценка содержания в плазме фактора роста эндотелия сосудов-а (VEGF-А), способствующего выживанию эндотелия [196], показала его

63 63 достоверное возрастание во всех клинических группах реципиентов, однако в 3-й группе с развитием в посттрансплантационный период острого отторжения аллогенной почки возрастание содержания VEGF-А было достоверно меньшим (в 3,7 раза), чем у пациентов с благоприятным течением посттрансплантационного периода (в 4,2 раза и в 6 раз сответственно). Становится очевидным, что ангиогенный фактор VEGF-A играет важную роль в широком диапазоне биологических и патологических процессов, например, продемонстрирована нефропатогенная роль VEGF-A [216]. Тогда как нейтрализация VEGF антителами предотвращала экспериментальную гломерулярную гипертрофию у лабораторных животных. Таким образом, можно предположить, что повышенное содержание VEGF-А у пациентов с ХБП перед трансплантацией является следствием основного заболевания и после трансплантации избыточное его количество негативно влияет на выживание трансплантата почки. Предтрансплантационная оценка тромбоцитарного фактора роста (PDGF- BB) выявила 3-х кратное его возрастание в плазме относительно контроля только во 2-й клинической группе реципиентов с ХБП, у которых, несмотря на выявление HLA-антител в посттрансплантационный период, острого отторжения трансплантата почки в течение 180 дней мониторинга обнаружено не было. Сопоставление наших данных с имеющимися сведения о высоком риске развития отторжения сердца у пациентов с высоким уровнем PDGF-BB [19] может свидетельствовать о выраженной зависимости характера изменения тромбоцитарного фактора роста от вида трансплантата, более специфичного для острого отторжения трансплантируемого сердца, но не почки. Наряду с данными литературы о том, что PDGF вызывает увеличение продукции сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и инсулиноподобного фактора роста (IGF) [149], нашими исследованиями у реципиентов 3-й клинической группы обнаружена сильная обратная корреляционная связь между PDGF-BB и VEGF-A (r = -1, p < 0,0001), что так же указывает на диагностическую значимость PDGF, как предиктора острого отторжения трансплантируемой почки у реципиентов с ХБП.

64 64 При анализе полученных данных обращает на себя внимание факт резкого возрастания содержания фактора роста стволовых клеток (SCF) у пациентов в терминальной стадии ХПБ, выявленного за 6 часов до трансплантации почки, однако не влияющий на ее отторжение в посттрансплантационный период, поскольку обнаруживается во всех клинических группах пациентов. Но поскольку рецепторы к SCF (SCF-R) экспрессируются не только предшественниками гемопоэтических лимфоидных клеточных линий, но и другими типами клеток и тканей, в том числе, и ткани почек [148], выявленное при ХБП возрастание в крови концентрации SCF можно расценивать как критерий тяжести патологии почек, но не как критерий возможного отторжения почечного трансплантата. В пользу такого предположения свидетельствуют недавно полученные данные о том, что повышенный уровень SCF влияет на ремоделирование сосудов [47]. Эпидермальный фактор роста (EGF) напротив, продемонстрировал пониженную концентрацию, достоверно отличающуюся от контрольной группы во всех клинических группах. Что касается уровня содержания плейотропного фактора ингибиции лейкозных клеток (LIF), то при отсутствии острого отторжения в динамике наблюдения после трансплантации почки (у пациентов 1-й и 2-й клинических групп) данный показатель был значительно ниже, чем у здоровых лиц и у пациентов 3-й группы, что позволяет использовать его в качестве критерия благоприятного течения посттрансплантационного периода. Несмотря на то, что LIF принадлежит к семейству IL-6, тесно связанного с иммунной агрессией и с отторжением трансплантата, однако на моделях животных с васкуляризированным аллотрансплантатом сердца было показано, что LIF является полярной противоположностью IL-6: экзогенный LIF подавлял дифференцировку Th17 и концентрацию IL-6, тем самым усиливая иммунную толерантность и наоборот [83]. Однако полученные нами клинические данные отличаются от результатов экспериментальных исследований на лабораторных животных, о чем свидетельствует установленная сильная прямая корреляционная

65 65 связь между LIF и IL-6 (r = 0,999, p < 0,0001) во 2-й и 3-й клинической группе реципиентов (r = 0,982, p < 0,0005). Следует отметить, что изменения многих ростовых факторов у реципиентов с ХБП имели характер тенденции и показатели их достоверно не отличались от возрастной нормы. Речь идет, в частности, о факторе роста нервов (NGF-β), факторе роста фибробластов (FGF-2), факторе роста гепатоцитов (HGF), плацентарном факторе роста (PIGF-1), факторе роста эндотелия сосудов-d (VEGF-D), что cвидетельствует об их низкой диагностической значимости при отторжении почечного трансплантата. Анализ полученных данных в целом позволяет заключить, что среди исследуемых факторов роста периферической крови пациентов с ХБП основным диагностически значимым ранним признаком отторжения трансплантируемой почки, следует считать двукратное увеличение в плазме IL-33 и резкое снижение содержания фактора, стимулирующего и поддерживающего развитие нейронов- BDNF, а маркером благоприятного течения посттрансплантационного периода достоверное снижение содержания фактора, ингибирующего лейкозные клетки- LIF и трехкратно сниженный уровень IL-7 в плазме за 6 часов до трансплантации почки. Наряду с этим, в качестве возможного дополнительного критерия острого отторжения трансплантируемой почки у больных с ХПБ можно считать более выраженное (в 20 раз), чем при благоприятном течении посттрансплантационного периода (в 10 раз), увеличение концентрации в периферической крови факторов роста лейкоцитов - колониестимулиующий гранулоцитарно-макрофагальный фактор (GM-CSF). 3.3 Оценка ассоциации предоперационного уровня хемокинов с выработкой анти-hla антител и развитием отторжения почки после трансплантации С учетом литературных данных о том, что предиктивные биомаркеры играют важную роль в выявлении отторжения трансплантата [70], интерес

66 66 представляют данные экспериментальных исследований о связи хемокинов и их рецепторов с хронической дегенерацией аллотрансплантата [192]. Актуальность исследований хемокинов в клинике обусловлена также тем, что в настоящее время недостаточно сведений о взаимосвязи исходного уровня хемокинов в сыворотке крови и осложненного течения посттрансплантационного периода при трансплантации почки у человека. В этой связи в настоящем исследовании за шесть часов до трансплантации почки у всех реципиентов с хронической болезнью почек (ХБП) оценивали концентрацию в плазме крови 5 хемокинов cемейства CC (англ. CC chemokine ligand) Eotaxin-1 (CCL11), MCP-1 (CCL2), MIP-1α (CCL3), MIP-1β (CCL4), RANTES (CCL5) и хемокинов семейства CXC (англ. CXC chemokine ligand) GRO-α (CXCL1), IL-8 (CXCL8), IP-10 (CXCL10), SDF-1α (CXCL12), MIG (CXCL9). Сравнительный анализ хемокинов семейства CXC, оценка которых была произведена за 6 часов до трансплантации почки реципиентам с ХБП, позволил констатировать, что ни один из определяемых CXC-хемокинов не был ассоциирован с острым отторжением трансплантата в период мониторинга, поскольку уровень их плазменной концентрации находился в пределах возрастной нормы (Таблица 3.3.1). Между тем предиктором благоприятного течения посттрансплантационного периода, можно считать SDF-1α (CXCL12), концентрация которого в плазме реципиентов до трансплантации в 1-й и 2-й клинической группе была в 1,6 раза ниже, чем у здоровых лиц. А вот достоверное увеличение содержания IL-8 (CXCL8) (в 3 раза), IP-10 (CXCL10) (в 1,6 раза) и GRO-α (CXCL1) в 10,43 раз у реципиентов 2-й клинической группы, которых от 1-й группы отличало наличие HLA-антител дает основание считать их предикторами антителогенеза (таблица 3.3.1). Следует отметить также, хемокин MIG (CXCL9), стимулирующий хемотаксис моноцитов и Т-лимфоцитов и снижающего пролиферацию гемопоэтических стволовых клеток не продемонстрировал диагностической значимости ни в качестве предиктора острого отторжения трансплантата, ни в

67 67 качестве критерия благоприятного исхода трансплантации, поскольку его содержание во всех клинических группах соответствовало таковому в группе здорового контроля. Таблица Концентрация хемокинов семейства CXC в плазме крови у пациентов с ХПБ перед трансплантацией почки (Мe [Q1 Q3]) Группа/ интер лейкины, пг/мл GRO-α (CXCL1) IL-8 (CXCL8) MIG (CXCL9) IP-10 (CXCL10) SDF-1α (CXCL12) Группа 1 Группа 2 (n=43) (n=7) Отсутствие острого отторжения Отсутствие Наличие HLA-антител HLA-антител 0 [0; 0] 10,43 [10,0; 25,37] р=0,001**^ 0 [0; 0] 3,04 [01,52;6,57] р=0,008**^ 94,61 92,72 [69,11; 111,91] [71,88; 151,3] p>0,05 p>0,05 128,21 [120,74;154,46] p>0, ,04 [1169,63; 1316,75] р=0,03*^ 209,20 [179,53; 276,69] р=0,015*^ 1522,44 [1495,42; 1626,92] р=0,03* Группа 3 (n=8) Группа 4 (n=20) Острое Контроль отторжение (здоровые Отсутствие доноры HLA-антител СПК 0 [0; 0] 0 [0; 0] 0 [0; 0] 0 [0; 0] 84,23 [67,08; 264] p>0,05 141,84 [135,79;249,23] p>0, ,97 [1511,70; 2612,19] p>0,05 63,85 [19,08; 105,81] 132,39 [80,68; 166,14] 1915,65 [1741,34; 2738] Примечание: *- р<0,05, **-р<0,01,***-р<0,001-достоверность отличий от контроля; ^-достоверность межгрупповых различий Таким образом, можно предположить, что сниженная концентрация CXCL12 в сыворотке крови у пациентов с ХБП перед трансплантацией является хорошим прогностическим признаком выживания трансплантата. При этом важно учесть, что о биологической активности в плазме крови SDF-1α (CXCL12), который экспрессируется стромальными клетками костного мозга и присутствует во многих тканях организма, на сегодняшний день крайне мало информации.

68 68 Известно, в частности, что мобилизация гемопоэтических стволовых клеток усиливается не только при стресс-индуцированном повреждении клеток (ДНК), при химиотерапии, но и под влиянием других хемокинов - CXCL12, CXCL8, CXCL1 [31]. В свою очередь активация CXCL12 в крови регулируется гранулоцитарными и тромбоцитарными протеазами, в связи с чем, повышение CXCL12 в плазме крови может быть связано с активацией нейтрофилов, адсорбируемых на полупроницаемых мембранах гемофильтра, используемых для гемофильтрации пациентов с хронической почечной недостаточностью при заместительной почечной терапии [178]. В экспериментах на лабораторных животных выявлено влияние провоспалительного цитокина IL-1β на экспрессию генов CXCL1 и CXCL2 с последующим усилением их продукции и секреции данных хемокинов [54], которые необходимы для миграции CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов, макрофагов, натуральных клеток-киллеров и антигенпрезентирующих клеток к месту повреждения, где они и вовлекаются в посттрансплантационные иммунные процессы. В связи с этим интерес представляют результаты корреляционного анализа о сильной положительной связи между повышением IL-1β и CXCL1 (коэффициент Пирсона r=0,959, p=0,001), а так же между CXCL8 и CXCL12 (коэффициентом Пирсона r=0,995 и p=0,0001) Между тем повышенный уровень CXCL8 в сыворотке крови перед трансплантацией, может оказывать негативное влияние на трансплантируемый орган и его жизнеспособность. Так известно, что CXCL8, являясь ранним провоспалительным хемокином, секретируемым мононуклеарными иммунными и эпителиальными клетками, индуцирует хемотаксис и активацию нейтрофилов, опосредованную фактором транскрипции NF-κB, однако чрезмерная экспрессия CXCL8 и избыточная миграция иммунных клеток может вызвать повреждение тканей, вызванное воспалением [27]. В группе пациентов с неосложненным посттрансплантационным периодом и наличием HLA-антител (группа 2) хемокин CXCL10 был в 1,6 раза выше

69 69 такового как у здоровых лиц (контрольная группа), так и у реципиентов 1 и 3 клинической группы (Таблица 3.3.1). Такой характер изменения хемокина CXCL10 соответствуют результатам исследования J. Zhuang с соавторвми (2014) по оценке данного хемокина, а также CXCL9 на мышиной модели гетеротопической ретрансплантации сердца, свидетельствующим о возможности использования возрастания CXCL9 и CXCL10 для прогнозирования острого отторжения [237], тогда как их нейтрализация продлевает время выживания аллотрансплантата за счет снижения инфильтрации мононуклеарных клеток и ослабления острого отторжения [222]. При этом следует учесть, что в наших исследованиях оценка CXCL10 в плазме крови реципиентов проводилась не после трансплантации, а за 6 часов до таковой, и наблюдаемое возрастание концентрации данного хемокина во 2-й группе пациентов является предиктором и играет ключевую роль в образовании антител против HLA-антигенов трансплантата и не связано с феноменом отторжения. Кроме того, не исключено, что возрастание CXCL10 в плазме является специфическим биомаркером отторжения сердечного трансплантата, но не почки. Анализируя в целом результаты оценки диагностической значимости исследуемых хемокинов семейства CXC следует заключить, что их нельзя считать предикторами острого отторжения, а скорее биомаркерами благоприятного течения посттрансплантационного периода с выработкой HLA антител в результате активации гуморального иммунного ответа. В частности, выявлено достоверное повышение в плазме крови реципиентов с ХБП за 6 часов до трансплантации GRO-α (CXCL1), IL-8 (CXCL8), IP-10 (CXCL10), а также снижение содержания SDF-1α (CXCL12), независимо от выявления HLA-антител. При анализе хемокинов семейства СС не удалось обнаружить диагностической значимости макрофагального провоспалительного белка - MIP- 1a (CCL3) в связи с тем, что его плазменный уровень во всех клинических группах находился в пределах возрастной нормы (таблица 3.3.2).

70 Таблица Концентрация хемокинов семейства CC в плазме крови пациентов с ХБП перед трансплантацией почки (Мe [Q1 Q3]) Группа/ интер лейкины, пг/мл MCP-1 (CCL2) MIP-1α (CCL3) MIP-1β (CCL4) RANTES (CCL5) Eotaxin (CCL11) 70 Группа 1 Группа 2 (n=43) (n=7) Отсутствие острого отторжения Отсутствие HLA-антител 160,31 [143,73; 184,71] p>0,05 10,46 [9,51; 10,78] p>0,05 762,60 [725,71; 795,44] p>0,05 674,94 [536,66; 882,88] p>0,05 152,68 [148,57; 157,49] p>0,05 Наличие HLA-антител 229,24 [215,56; 263,57] p>0,05 15,01 [13,54; 17,82] p>0,05 854,80 [839,57; 941,91] р=0,002** 806,30 [760,91; 1084,98] р=0,007** 175,44 [163,09; 189,05] p>0,05 Группа 3 (n=8) Острое отторжение Отсутствие HLA-антител 282,39 [253,21; 320,34] р=0,007**^ 12,38 [11,69; 41,50] p>0,05 877,34 [847,38; 909,68] р=0,002** 521,85 [410,51; 585,37] p>0,05 94,16 [88,84; 113,63] р=0,0002***^ Группа 4 (n=20) Контроль (здоровы е доноры СПК 101,03 [72,43; 243,71] 17,04 [9,85; 21,23] 734,25 [718,34; 779,88] 144,32 [134,76; 535,18] 290,16 [168,55; 331,20] Примечание: *- р<0,05, **-р<0,01,***-р<0,001-достоверность отличий от контроля; ^-достоверность межгрупповых различий Между тем в отличие от CXC-хемокинов (CXCL8, CXCL10, CXCL8), как критериев неосложненного посттрансплантационного периода, в исследовании определены CC-хемокины, которые можно считать предикторами острого отторжения трансплантата почки у реципиентов с ХБП. В частности, показано, что только у реципиентов 3 клинической группы с осложненным течением послеоперационного периода было обнаружено достоверное повышение MCP- 1(CCL2) в 2,7 раза (р=0,007) и почти двукратное снижение Eotaxin (CCL11) (Таблица 3.3.2).

71 71 CCL2 (моноцитарный хемоаттрактантный белок-1) не только индуцирует направленную клеточную миграцию моноцитов и макрофагов в тканевые участки воспаления, но и играет важную роль в гуморальном отторжении трансплантата почки и сердца у мышей, стимулируя воспаление и выработку HLA антител [23]. В этой связи нашими исследованиями показано, что высокий уровень CCL2, как биомаркера острого отторжения почки, может обнаруживаться в плазме не только после развития осложнения, но и за 6 часов до трансплантации органа, то есть служит предиктором острого отторжения. В то время как в 1-й группе реципиентов с неосложненным течением посттрансплантационного периода (без HLA-антител) все исследуемые CCхемокины соответствовали норме, во 2-й группе (с HLA-антителами) MIP-1β (CCL4) и, особенно, RANTES (CCL5) достоверно превышали таковую (в 1,2 раза и в 5,6 раза соответственно) (таблица 3.3.2). Что касается хемокина CCL5, то он, как хемоатрактант для миелоидных клеток, играет важную роль в рекрутировании лейкоцитов (Т-лимфоцитов, макрофагов), тромбоцитов, а также эпителиальных клеток и фибробластов в место повреждения, и синергично с IL-2 и IFN-γ вызывает активацию и пролиферацию СС-хемокин-активированных NK-клеток [5]. Тканеспецифический CCL5 вносит существенный вклад в повреждение трансплантированной печени у мышей, поскольку у мышей с недостаточностью экспрессии имело место значительное снижение направленной миграции макрофагов во время ранней реперфузии после 1-часовой ишемии печени [126]. Таким образом, CCL5 может представлять перспективный критерий для разработки новых терапевтических стратегий против повреждений солидных органов, связанных с их ишемией и реперфузией во время трансплантации. Полученные данные о дефиците Eotaxin (CCL11), как о предикторе отторжения почки, представляют особый интерес, поскольку его роль в патогенезе отторжения почки недостаточно изучена, а его диагностическое значение продемонстрировано при других видах трансплантируемых органов. В частности, при трансплантации и патологии легких, напротив, отмечена повышенная концентрация CCL11 (в 2,5 раза), а также экспрессия CCR3-

72 72 рецепторов эозинофилов к эотаксину, свойственны хроническому отторжению легкого [73], что может быть связано со способностью эотаксинов (в том числе и CCL11) участвовать в аномальной неоваскуляризации в дыхательных путях при воспалении [30]. Кроме того выявлено увеличение экспрессии мрнк CCL11 в аллотрансплантантах аорты крыс, подвергнутых длительной ишемии [16, 92]. Анализируя в целом результаты оценки диагностической значимости исследуемых хемокинов семейства CC следует заключить, что предикторами острого отторжения почечного трансплантата у реципиентов с ХБП можно считать увеличение в плазме концентрации MCP-1 (CCL2) и выраженный дефицит эотаксина CCL11, а биомаркером неосложненного течения посттрансплантационного периода с выработкой HLA-антител резкое (более чем в 5 раз) увеличение плазменной концентрации RANTES (CCL5). 3.4 Оценка ассоциации предоперационного уровня интерферонов с выработкой анти-hla антител и развитием отторжения почки после трансплантации Иммунорегуляторная активность интерферонов (IFN) проявляется преимущественно в усилении Th1-зависимого клеточного иммунитета [22, 46]. Следует отметить, что данные о роли IFN-γ в судьбе трансплантируемой почки весьма противоречивы. Так по сведениям одних авторов IFN-γ способен продлевать выживаемость трансплантата за счет снижения некроза тканей [64], тогда как большинство исследователей отмечают его стимулирующее действие на активность CD8 + T-клеток с последующим отторжением трансплантата, равно как и улучшение выживаемости аллотрансплантата сердца [236]. Наряду с этим, еще в 90-е годы прошлого столетия S.F. Lui (1992) и P. Kramer (1984) было показано, что профилактика вирусных инфекций препаратами интерферонов при трансплантации почки сопровождалась увеличением случаев отторжения трансплантата. Изложенные факты послужили основанием для исследования содержания двух основных классов IFN (IFNα и IFNγ) в плазме

73 73 реципиентов с ХБП за 6 часов до трансплантации почки для оценки их в качестве предикторов острого отторжения трансплантата. Сравнительный анализ полученных данных показал, что концентрация IFNα в плазме крови реципиентов почки с ХБП до трансплантации имела однонаправленное достоверное повышение во всех клинических группах. Однако, в группе с наличием острого отторжения (группа 3) концентрация IFNα была наиболее высокой и в 5 раз превышала уровень таковой в 1 и 2 клинической группе с неосложненным течением послеоперационного периода (таблица 3.4.1). Сходное увеличение плазменной концентрации было обнаружено при анализе содержания IFN-γ, однако значение данного показателя как предиктора острого отторжения почки не удалось установить в виду того, что данные клинически благоприятной группы (группа 2) и 3 группы (с острым отторжением трансплантата) были сопоставимы и, в среднем, в 4 раза превышали возрастную норму (таблица 3.4.1). Таблица Концентрация IFNα и IFNγ в плазме крови у реципиентов с ХПБ перед трансплантацией почки (Мe (Q1 Q3)) Группа/ IFN, пг/мл Группа 1 Группа 2 (n=43) (n=7) Отсутствие острого отторжения Отсутствие HLA-антител Наличие HLA-антител Группа 3 (n=8) Острое отторжение Отсутствие HLA-антител Группа 4 (n=20) Контроль (здоровые доноры СПК IFN-α 0,29[0,16; 1,33] 0,33[0,27; 2,98] 1,59[1,32; 3,47] 0 [0; 0,23] р=0,04* р=0,02* р=0,0002*** IFN-γ 49,28 [44,50; 74,42] р=0,0008*** 78,71 [64,60;189,72] р=0,0004*** 72,28 [54,97; 73,66] р=0,0004*** 19,05 [10,47;24,1] Примечание: *- р<0,05, **-р<0,01,***-р<0,001-достоверность отличий от контроля; ^-достоверность межгрупповых различий Между тем следует отметить, что в 1 группе реципиентов с наиболее благоприятным исходом трансплантации (без острого отторжения, без HLA-

74 74 антител) содержание IFN-γ было только в 2,5 раза выше контроля и в 1,5 раза ниже такового в других клинических группах (таблица 3.4.1). Таким образом, результаты исследований IFNα и IFNγ продемонстрировали достоверное их увеличение в плазме пациентов с ХБП перед трансплантацией почки, однако следует считать прогностически благоприятным возрастание IFNγ в диапазоне от 44,50 до 74,42 пг/мл, что означает превышение уровня физиологической нормы не более чем в 2,5 раза, тогда как более значительное увеличение концентрации IFNγ повышает риск угрозы выживаемости аллогенного трансплантата и коррелирует с образованием HLA антител даже в группе с неосложненным течением посттрансплантационного периода наблюдений (группа 2). 3.5 Оценка ассоциации предоперационного уровня факторов некроза опухоли с выработкой анти-hla нтител и развитием отторжения почки после трансплантации Являясь провоспалительным цитокином, фактор некроза опухоли-альфа (TNF-α) вызывает активацию эндотелиальных клеток в очаге воспаления с повышением активности молекул клеточной адгезии и экспрессии MHCрецепторов, что может обуславливать его участие в посттрансплантационном воспалении. Это предположение находится в соответствии с современными сведениями о достоверной ассоциации высоких уровней содержания TNF-α крови с неблагоприятными клиническими исходами у пациентов с острой почечной недостаточностью в виде долгосрочного риска хронического заболевания почек, почечной недостаточности и летального исхода [204]. Наряду с этим скрининг полиморфизма гена TNFα в последние годы установил возможность прогнозировать вероятность острого отторжения почечного трансплантата по носительству аллеля 308 А в сочетании с высоким уровнем TNFα в сыворотке крови и обосновать необходимость более интенсивной иммуносупрессивной терапии реципиентов [189]. Это, в свою очередь, явилось

75 75 основанием для поиска новых молекулярных предикторов отторжения трансплантата путем определения содержания в плазме крови реципиентов с ХБП факторов некроза опухоли основных классов (TNFα и TNFβ) за 6 часов до трансплантации аллогенной почки. Исследованиями показано, что у пациентов с ХБП имеет место достоверное увеличение концентрации в плазме TNFα, тогда как TNFβ не обнаружен, ни у условно здоровых лиц, ни у пациентов клинических групп. При этом наиболее выраженное возрастание плазменной концентрации TNFα (более чем в 6 раз) наблюдалось у реципиентов с развившимся в последствии острым отторжением почечного трансплантата, а также было достоверно повышенным (в 3,4 раза) во 2-й клинической группе (наличие HLA-антител, но без развития острого отторжения) (таблица 3.5.1). Таблица Концентрация факторов некроза опухоли в плазме крови пациентов с ХБП перед трансплантацией почки (Мe (Q1 Q3)) Группа/ TNF, Группа 1 (n=43) Группа 2 (n=7) Группа 3 (n=8) Группа 4 (n=20) пг/мл Отсутствие острого отторжения Острое отторжение Контроль (здоровые Отсутствие HLA-антител Наличие HLA-антител Отсутствие HLA-антител доноры СПК TNFα 8,41 [5,19;12,15] p>0,05 7,16 [7,16; 10,18] р=0,004** 13,22 [9,48;14,76] р=0,002** 2,12 [1,57; 4,11] TNF-β 0 [0; 0] 0 [0; 0] 0 [0; 0] 0 [0; 0] Примечание: *- р<0,05, **-р<0,01,***-р<0,001-достоверность отличий от контроля; ^-достоверность межгрупповых различий Таким образом, нашими исследованиями был установлен факт исходно высокого уровня провоспалительного TNF-α у реципиентов с ХБП накануне трансплантации, однако выявить надежный прогностический критерий ее отторжения не представляется возможным из-за сходства направленности изменений в клинических группах обследуемых.

76 76 Резюме Таким образом, можно заключить, что данные уровня цитокинов, полученные перед трансплантацией обладают диагностической значимостью и могут быть использованы как предикторы оценки течения посттрансплантационного периода и развития острого отторжения. Так, по нашим данным предикторами острого отторжения трансплантата можно считать: повышенный уровень IL-17А в диапазоне от 1,05 пг/ мл до 3,78 пг/мл выше (р=0,003); повышение IL-1RA в диапазоне от 805 пг/мл до 1320,15 пг/мл (р=0,002); снижение BDNF в диапазоне от 0 пг/мл до 16,12 пг/мл (р=0,0002); повышение IL-33 в диапазоне от 0,580 пг/мл до 2,43 пг/мл (р 0,0001); повышенный уровень CCL2 в пределах 253,21 пг/мл до 320,34 пг/мл (р 0,0001); сниженный уровень CCL11 в диапазоне 88,84 пг/мл до 113,63 пг/мл (р=0,0001). Предикторами благополучного выживания аллотрансплантата почки, по нашим данным являются: отсутствие IL-27 или его концентрация, не превышающая значения 0-40,94 пг/мл (р=0,001); крайне низкое содержание LIF в концентрации от 0 0,98 пг/мл (р=0,0003); снижение концентрации IL-7 в диапазоне от 1,35 пг/мл до 2,81 пг/мл (р=0,003). Достоверными предикторами вероятности появления HLA-антител можно считать:

77 77 концентрацию IL-1β в пределах от 1,83 пг/мл до 5,03 пг/мл и выше (р=0,002); концентрацию IL-6 в пределах 12,55 46,16 пг/мл (р=0,004); повышение концентрации IL-18 в диапазоне от 186,13 пг/мл до 650,83пг/мл (р 0,0001); концентрация CХCL1 в пределах 10,0 45,37 пг/мл (р=0,0002); концентрация CХCL8 в пределах 1,52 6,57 пг/мл (р=0,007); концентрация CХCL10 в пределах 179,53 276,69 пг/мл (р=0,005); уровень содержания CCL5 от 760,91 пг/мл до 1084,98 пг/мл и выше (р=0,003); уровень PDGF-BB в пределах от 660,88 пг/мл до 1303,51 пг/мл (р=0,002). Материалы данной главы опубликованы в следующих работах: 1. Федоренко, Т.В. Ранние интерлейкиновые маркеры риска острого отторжения при трансплантации почки / Т.В. Федоренко, Н.В. Колесникова, Е.Ф. Филиппов // Российский иммунологический журнал Т. 11, 3. С Федоренко, Т.В. Про- и противовоспалительные цитокины ранние маркеры острого отторжения трансплантируемой почки / Т.В. Федоренко, Н.В. Колесникова, Е.Ф. Филиппов // Кубанский научный медицинский вестник Т.25, 3. С Федоренко, Т.В. Факторы роста предикторы острого отторжения трансплантата почки / Т.В. Федоренко, Н.В. Колесникова // Тез. докл. Междун. научн.-практ. конф. «Молекулярная диагностика 2018» С Федоренко, Т.В. Диагностическая значимость факторов роста в раннем прогнозе острого отторжения аллогенной почки / Т.В. Федоренко, Н.В.

78 78 Колесникова, Е.Ф. Филиппов // Цитокины и воспаление Т.17, 1-2. С Патент Российская Федерация МПК G01N 33/48 ( ). Способ прогнозирования риска отторжения почки до ее трансплантации : : заявл : опубл / Федоренко Т.В., Колесникова Н.В. ; заявитель ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России. 12 с. : ил. Текст : непосредственный. 6. Федоренко, Т.В. Ранние цитокиновые предикторы острого отторжения трансплантата почки / Т.В. Федоренко, Н.В. Колесникова, И.А. Пашкова // Российский иммунологический журнал Т.13(22), 2. С

79 79 Глава 4. Диагностическая роль цитокинов в посттрансплантационном мониторинге осложнений В настоящее время доказано, что врожденные иммунные реакции, запускаемые после трансплантации вследствие повреждения тканей, инфекций и реперфузионного повреждения, являются важным элементом воспалительного процесса, приводящего к раннему отторжению аллотрансплантатов. Поскольку комплексный ответ иммунной системы на имплантированный трансплантат может меняться во время долгосрочного наблюдения, в любой момент после трансплантации Т-эффекторная активность, связанная с увеличением производства и высвобождением провоспалительных цитокинов, может быть суррогатным маркером риска отторжения и необходимости проведения иммуносупрессивной терапии, которая может иметь различный эффект у каждого отдельного пациента [53]. Между тем мониторинг панели действительных биомаркеров может улучшить стратификацию пациентов, выбор иммунодепрессантов и, в целом, на основе предсказания эпизодов отторжения, корректировать прогноз повреждения аллотрансплантата и ответа индивидуума на лекарственную терапию. За период с 2009 по 2018 годы в ГБУЗ «НИИ-ККБ 1 им. проф. С.В.Очаповского» было выполнено 336 трансплантаций почки, причем 3 из них от живого донора, все остальные от кадаверных доноров. Между тем многочисленные исследования свидетельствуют о том, что смерть мозга оказывает пагубное влияние на функцию аллотрансплантата, в отличие от трансплантатов живых доноров. Так, например, смерть мозга усиливает выброс воспалительных цитокинов и хемокинов в трансплантат, включая продукцию интерлейкина-1β (IL-1β), IL-6, фактора некроза опухоли-α (TNF-α), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), интерферона-γ (IFN-γ), моноцитарного хемоатрактантного белка-1 (MCP-1) и усиливает экспрессию основных комплексов гистосовместимости (МНС) II класса и молекул адгезии (например, E-селектин) [153].

80 80 Основываясь на предположении о том, что изменение концентрации цитокинов в посттрансплантационном периоде может свидетельствовать о дисфункции трансплантата и повышенном риске его потери, в плазме крови реципиентов почки на 7, 30, 90 и 180 день после трансплантации оценивали содержание 21 про- и противовоспалительного интерлейкина, 16 факторов роста, 11 хемокинов, а также 2 видов интерферонов и 2 видов фактора некроза опухоли методом мультиплексного анализа. 4.1 Оценка динамики про- и противовоспалительных интерлейкинов в различные сроки после трансплантации, ассоциированных с осложненным и не осложненным течением посттрансплантационного периода При анализе медиан выборок концентрации интерлейкинов в плазме крови реципиентов почки в различные сроки после трансплантации по сравнению с исходным предтрансплантационным уровнем обращает на себя внимание различие в динамике биомаркеров в группах сравнения (Приложение А). В 1 группе, характеризующейся отсутствием HLA-антител и острого отторжения, наблюдается изменение уровня провоспалительных цитокинов на протяжении всего периода наблюдения. Однако обращает на себя внимание, что уровень IL-18 и IL-1β к 180 дню оставались значительно выше исходного уровня (в 1,7 и 101 раз соответственно), тогда как изменения IL-17A и IL-27 были статистически не значимы, содержание IL-12р70 незначительно снизилось к 30 дню, но к 180 дню вновь возросло до исходного уровня. Концентрация IL-6, напротив, увеличилась к 90 дню в 12,6 раз, но к 180 дню так же вернулась к исходному уровню (рисунок ). Как известно из литературных данных внутри тканей большое количество IL-1β могут выделять в основном резидентные дендритные клетки, макрофаги и нейтрофилы, тогда как паренхимные клетки могут выделять только небольшие количества при определенных обстоятельствах [28]. Таким обстоятельством для трансплантата может быть повреждение клеток почечного эпителия и

81 концентрация, пг/мл концентрация, пг/мл 81 некротическая их гибель, которая активирует воспаление и секрецию IL-1β и IL IL IL-18 IL-27 IL-1beta IL-12p70 IL-17A 0 до тр 7 дн 30 дн 90 дн 180 дн сроки после трансплантации (в днях) 0 Рисунок Динамика концентрации провоспалительных интерлейкинов в сыворотке крови реципиентов почки с отсутствием острого отторжения трансплантата и HLA-антител. При оценке динамики противовоспалительных цитокинов у пациентов данной выборки наблюдается повышение на 180 день IL-4 в 1,3 раза по сравнению с предтрансплантационным уровнем и IL-1RA в 1,9 раз (рисунок 4.1.2). Рецепторный антагонист IL-1RA ингибирует активность IL-1β, а IL-4 ограничивает синтез IL-1β и IL-6, тем самым защищая ткань почки от дальнейшего повреждения. Уровень IL-13 постепенно снижался до минимального значения на 30 день после трансплантации, но к 180 дню возвращался к исходному значению. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что, не смотря на отсутствие у пациентов данной группы HLA-антител и острого отторжения трансплантата, происходит воспалительное повреждение ткани, которое в данный период наблюдения (до 180 дней) может быть компенсировано.

82 концентрация, пг/ил концентрация, пг/мл IL-1RA IL-4 IL до тр 7 дн 30дн 90дн 180дн 0 сроки после трансплантации (в днях) Рисунок Динамика концентрации противоспалительных интерлейкинов в сыворотке крови реципиентов почки без антител и без осложнений. Между тем анализ данных изменения концентрации провоспалительных интерлейкинов в группе 2, с наличием HLA-антител и отсутствием острого отторжения трансплантата показал скачкообразные повышения и понижения биомаркеров на протяжении всего срока наблюдения (рисунок 4.1.3). Так уровень IL-6 повышался к 90 дню до уровня, в 7,8 раза превышающего предыдущие уровни, включая исходный (р=0,01), что по времени совпадает с появлением HLA-антител (время появления антител 90±48,9 дней). Между тем в экспериментальных работах на животных показано, что реперфузионное ишемическое повреждение ткани увеличивает уровень IL-6 внутри трансплантата, основными продуцентами которого являются АПК и ДК и стимулирует дифференцировку Th17 [212]. К 90-му дню мониторинга начинается подъем и IL-17A и достигает максимума на 180 день (р=0,03). Отсутствие или блокада IL-6 было связано со значительным снижением острого и хронического отторжения, а так же снижением аллоспецифического иммунного ответа у мышей после трансплантации сердца [212].

83 концентрация, пг/мл концентрация, пг/мл IL-6 IL-18 IL-27 IL-1beta IL-12p IL-17A 0 до тр 7 дн 30 дн 90 дн 180 дн сроки после трансплантации (в днях) 0 Рисунок Динамика концентрации провоспалительных интерлейкинов в сыворотке крови реципиентов почки с отсутствием острого отторжения трансплантата и наличием HLA-антител. Биомаркеры IL-1β, IL-18 и IL-12р70 имели максимальные значения накануне обнаружения HLA-антител, на 30 день с последующим снижением в точке 90 дней, при этом IL-12р70 на 180 день опять повышался и был в 1,3 раза выше исходного уровня (р=0,01). Медианы всех измерений IL-12р70 в группе 2, имели значимые отличия от таковых в группе 1 и группе 3 (р<0,0001). Изменения концентрации IL-27 на протяжении всего периода наблюдения оказались достоверно не значимыми. Что касается динамики противовоспалительных интерлейкинов (рисунок 4.1.4), то уровень IL-1RA после снижения на 30 день начал увеличиваться и достиг своего максимума на 180 день, продемонстрировав значения в 2,7 раз превышающие исходный уровень (р=0,003). При этом IL-4 продемонстрировал противоположную направленность, так как после максимально высоких значений на 30 день его концентрация стала снижаться, оказавшись на 180 день в 3 раза ниже исходного уровня, но уровень этого биомаркера во всех других точках был выше, чем в других клинических группах.

84 концентрация, пг/мл концентрация, пг/мл концентрация, пг/мл IL-1RA IL-4 IL до тр 7 дн 30 дн 90дн 180 сроки после трансплантации (в днях) 0 Рисунок Динамика концентрации противоспалительных интерлейкинов в сыворотке крови реципиентов почки с отсутствием острого отторжения трансплантата и наличием HLA-антител. В группе 2 (отсутствие острого отторжения и наличие HLA-антител) уровень противовоспалительного IL-13 был самым высоким по сравнению с группой 1 и группой 3 во всех временных точках измерения (рисунок 4.1.5) до тр 7 дн 30 дн 90 дн 180 дн сроки после трансплантации (в днях) IL-13 группа 1 группа 2 группа 3 Рисунок Уровень IL-13 в плазме крови пациентов за период наблюдения, р=0,008 по критерию Фридмана. Динамические изменения медиан провоспалительных интерлейкинов в группе 3 с острым отторжением и отсутствием HLA-антител на момент

85 концентрация пг/мл концентрация пг/мл 85 отторжения имели более однонаправленный характер (рисунок 4.1.6). Так IL-1β не продемонстрировал, какой бы то ни было динамики. В отличие от группы 2 IL- 6, достоверно снижался до 90 дня, а на 180 день вернулся к исходному уровню (р=0,007). Биомаркер IL-12р70 показал незначительные колебания концентрации на протяжении всего периода наблюдения с максимальной концентрацией на 180 день в 1,02 раза выше предтрансплантационного уровня, но ниже, чем в группе IL-6 IL-18 IL-27 IL-1beta IL-12p70 IL-17A 0.00 до тр 7 дн 30дн 90дн 180 дн сроки после трансплантации (в днях) 0.00 Рисунок Динамика изменения концентрации провоспалительных интерлейкинов в сыворотке крови реципиентов почки с наличием острого отторжения трансплантата и отсутствием HLA-антител на момент отторжения. Совершенно иной характер изменений продемонстрировали IL-17А, IL-18 и IL-27. Динамика этих трех интерлейкинов была сходной (рисунок 4.1.6), поскольку все три маркера имели минимальные значения концентрации на 30 день и затем начинался подъем, который достигал максимальных значений на 180 день среднее время наступления острого отторжения (157,5±52,58 дней). Только в группе 3 с острым отторжением и отсутствием HLA-антител концентрация IL-17А имела самые высокие значения (рисунок 4.1.7), а динамика уровня IL-17А была достоверно значимой на протяжении всего периода наблюдения и достоверно отличалась от таковой в группе 1 и группе 2 (р=0,005).

86 концентрация, пг/мл концентрация, пг/мл концентрыция, пг/мл до тр * * * * 7 дн 30 дн 90 дн сроки после трансплантации (в днях) 180 дн ** группа 3 группа 2 группа 1 IL-17A Рисунок Уровень IL-17А в плазме крови пациентов за период наблюдения, р=0,005 по критерию Фридмана. Максимальный уровень IL-27 на 180 день так же был достоверно выше такового в группах 1и 2 (р=0,03). Как известно IL-27 является не только индуктором Th ответа, но и ингибитором IL-6 и IL-12р70, а также основным участником реакции «трансплантат против хозяина» [225] IL-1RA IL-4 IL до тр 7 дн 30 дн 90дн 180дн сроки после трансплантации (в днях) 0.00 Рисунок Динамика концентрации противоспалительных интерлейкинов в сыворотке крови реципиентов почки с с наличием острого отторжения трансплантата и отсутствием HLA-антител.


Профессор Москалёв Александр Витальевич (Военно-медицинская академия) Особенности развития реакций гипечувствительности с участием механизмов

Профессор Москалёв Александр Витальевич (Военно-медицинская академия) Особенности развития реакций гипечувствительности с участием механизмов Профессор Москалёв Александр Витальевич (Военно-медицинская академия) Особенности развития реакций гипечувствительности с участием механизмов врожденного иммунитета Иммунные реакции представляют собой

Подробнее

Научная новизна диссертационного исследования

Научная новизна диссертационного исследования неспецифических иммуносупрессивных препаратов, главным образом, цитостатиков и кортикостероидов, имеющих большое количество побочных эффектов и негативно влияющих на организм ребенка в период его интенсивного

Подробнее

Определение HLA-антител для успешной трансплантации почки

Определение HLA-антител для успешной трансплантации почки Определение HLA-антител для успешной трансплантации почки Общие сведения Предсуществующие HLA-антитела, образовавшиеся в результате гемотрансфузий, беременностей или предыдущих трансплантаций, совпадая

Подробнее

4. Перечень разделов и (или) тем дисциплины и их дидактическое содержание Наименование раздела Содержание раздела (темы) компетенции п/п

4. Перечень разделов и (или) тем дисциплины и их дидактическое содержание Наименование раздела Содержание раздела (темы) компетенции п/п 1. Целью изучения дисциплины является: формирование у студентов представления об общих закономерностях развития, структурно - функциональной организации иммунной системы. 2. Задачи, решаемые в ходе освоения

Подробнее

АННОТАЦИЯ РАБОЧЕЙ ПРОГРАММЫ ДИСЦИПЛИНЫ «ИММУНОЛОГИЯ»

АННОТАЦИЯ РАБОЧЕЙ ПРОГРАММЫ ДИСЦИПЛИНЫ «ИММУНОЛОГИЯ» МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет

Подробнее

отзыв Актуальность темы

отзыв Актуальность темы отзыв официального оппонента доктора медицинских наук, профессора Балмаеоной Ирины Петровны на диссертацию Брагвадзе Беллы Гелаевны «Особенности врожденного иммунитета у детей с бронхиальной астмой», представленной

Подробнее

отзыв иммунология, аллергология Актуальность темы вовлечении факторов врожденного иммунитета в патогенез самых

отзыв иммунология, аллергология Актуальность темы вовлечении факторов врожденного иммунитета в патогенез самых отзыв официального оппонента, доктора медицинских наук, профессора Калюжина Олега Витальевича на диссертацию Огурцовой Анастасии Дмитриевны «Анализ экспрессии и функциональной активности ТоНподобных рецепторов

Подробнее

приобретение студентами знаний об основных структурно-функциональных особенностях

приобретение студентами знаний об основных структурно-функциональных особенностях 1. Целью изучения дисциплины является: овладение знаниями общих закономерностей развития, структуры и функции иммунной системы организма в норме и при заболеваниях, обусловленных нарушением иммунных механизмов,

Подробнее

Актуальность темы диссертации.

Актуальность темы диссертации. Отзыв официального оппонента доктора медицинских наук, профессора Ляминой Надежды Павловны на диссертацию Гордеевой Марии Алексеевны «Значение провоспалительных цитокинов в патогенезе и клинике острого

Подробнее

3' 15. В.П. Никулина, Г.В. Булава, М.А. Годков ГБУЗ «НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского ДЗМ», Москва

3' 15. В.П. Никулина, Г.В. Булава, М.А. Годков ГБУЗ «НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского ДЗМ», Москва 3' 15 В.П. Никулина, Г.В. Булава, М.А. Годков ГБУЗ «НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского ДЗМ», Москва Докладчик Валентина Петровна Никулина, sa-to@yandex.ru V.P. Nikulina, G.V. Bulava, M.A. Godkov

Подробнее

Синдром Гудпасчера, алгоритмы лабораторной диагностики.

Синдром Гудпасчера, алгоритмы лабораторной диагностики. Синдром Гудпасчера, алгоритмы лабораторной диагностики. Юбилейный ХХ Форум «Национальные дни лабораторной медицины России - 2016» Москва, 14-16 сентября 2016 г. Моруга Р. А., д.м.н. Казаков С.П. Синдром

Подробнее

Курсовая работа+ по теме:1 «Презентация внутриклеточных и внеклеточных антигенов»1

Курсовая работа+ по теме:1 «Презентация внутриклеточных и внеклеточных антигенов»1 Московский государственный университет Физический факультет Курсовая работа+ по теме: «Презентация внутриклеточных и внеклеточных антигенов» Выполнил: Иноземцев В.А., гр. 202 Москва 203 Общие сведения

Подробнее

иммунопатологических сдвигов при различных формах и стадиях заболевания. Теоретическая значимость исследования обоснована тем, что: доказаны

иммунопатологических сдвигов при различных формах и стадиях заболевания. Теоретическая значимость исследования обоснована тем, что: доказаны Заключение комиссии диссертационного совета Д 208.114.01 в Федеральном бюджетном учреждении науки «Центральный научноисследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты

Подробнее

Проректор по научно-исследовательской и клинической работе ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский Университет),

Проректор по научно-исследовательской и клинической работе ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский Университет), «УТВЕРЖДАЮ» Проректор по научно-исследовательской и клинической работе ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский Университет), Федерального государственного автономного образовательного

Подробнее

Методология оценки иммунного статуса Зав. лабораторией АНО "ВЕРА" Б.А. Никулин

Методология оценки иммунного статуса Зав. лабораторией АНО ВЕРА Б.А. Никулин - 1 - Методология оценки иммунного статуса Зав. лабораторией АНО "ВЕРА" Б.А. Никулин Для оценки иммунного статуса по патогенетическому принципу в лаборатории «ВЕРА» мы используем следующие наборы тестов

Подробнее

Вопросы по курсу иммунологии

Вопросы по курсу иммунологии Вопросы по курсу иммунологии - 2015. 1. Механизмы распознавания бактерий клетками врожденного иммунитета. 2. Механизмы распознавания вирусов клетками врожденного иммунитета. 3. Главные принципы иммунологического

Подробнее

Научная платформа Инновационные фундаментальные технологии в медицине

Научная платформа Инновационные фундаментальные технологии в медицине Циркулирующие микрочастицы в качестве эндогенных носителей нуклеиновых кислот при патогенезе воспалительных и ишемических состояний сердечно-сосудистой системы Актуальность исследования Циркулирующие нуклеиновые

Подробнее

официального оппонента доктора медицинских наук, профессора, Аршинова Андрея Владимировича

официального оппонента доктора медицинских наук, профессора, Аршинова Андрея Владимировича отзыв официального оппонента доктора медицинских наук, профессора, Аршинова Андрея Владимировича на диссертационную работу Меснянкиной Анны Александровны «Динамика субпопуляций В- лимфоцитов у пациентов

Подробнее

ОТЗЫВ ВЕДУЩЕЙ ОРГАНИЗАЦИИ

ОТЗЫВ ВЕДУЩЕЙ ОРГАНИЗАЦИИ «УТВЕРЖДАЮ» Ректор Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Воронежская государственная медицинская академия имени Н.Н. Бурденко» Министерства здравоохранения

Подробнее

Достоверность и обоснованность результатов, выводов и рекомендаций

Достоверность и обоснованность результатов, выводов и рекомендаций ОТЗЫВ официального оппонента на диссертационную работу Смолькова Ивана Владимировича «Иммуногенетические механизмы развития ишемического инсульта мозга», представленную на соискание ученой степени кандидата

Подробнее

«УТВЕРЖДАЮ» Проректор по научной работе

«УТВЕРЖДАЮ» Проректор по научной работе «УТВЕРЖДАЮ» Проректор по научной работе ведущей организации Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Российский национальный исследовательский медицинский

Подробнее

Молекулярные маркеры в сыворотке крови и в моче в процессе лечения пиелонефрита

Молекулярные маркеры в сыворотке крови и в моче в процессе лечения пиелонефрита ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И.Разумовского» Министерства здравоохранения РФ НИИ фундаментальной и клинической уронефрологии ЗАО «Вектор Бест» Новосибирск* Молекулярные маркеры в сыворотке крови и в

Подробнее

отзыв Актуальность темы диссертации

отзыв Актуальность темы диссертации отзыв ведущей организации о научно-практической значимости диссертационной работы П. В. Сарапа «Оптимизация иммунотропной терапии при ургентной хирургической патологии с учетом кластерной организации иммунной

Подробнее

Пресепсин: маркер динамики состояния у пациентов с ВБИ

Пресепсин: маркер динамики состояния у пациентов с ВБИ Пресепсин: маркер динамики состояния у пациентов с ВБИ 19 июня 2017 https://www.zdrav.ru/articles/4293657597-17-m6-19-presepsin-marker-dinamiki Пресепсин традиционно понимается как высокоточный маркер

Подробнее

ОТЗЫВ ОФИЦИАЛЬНОГО ОППОНЕНТА

ОТЗЫВ ОФИЦИАЛЬНОГО ОППОНЕНТА ОТЗЫВ ОФИЦИАЛЬНОГО ОППОНЕНТА на диссертацию Боробовой Елены Александровны «Разработка и изучение свойств искусственных полиэпитопных антигенов меланомы», представленную на соискание ученой степени кандидата

Подробнее

Заключение комиссии диссертационного совета Д

Заключение комиссии диссертационного совета Д Заключение комиссии диссертационного совета Д 208.114.01 в Федеральном бюджетном учреждении науки «Центральный научноисследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты

Подробнее

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ УТВЕРЖДАЮ Первый заместитель министра Д.Л. Пиневич 25.11.2016 Регистрационный 101-1116 МЕТОД ИНДУКЦИИ ИММУНОСУПРЕССИИ С ПРИМЕНЕНИЕМ АЛЛОГЕННЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ

Подробнее

ОТЗЫВ Актуальность темы исследования

ОТЗЫВ Актуальность темы исследования ОТЗЫВ официального оппонента доктора медицинских наук, профессора Абдулхакова Рустама Аббасовича на диссертационную работу Степиной Екатерины Александровны «Клинико-лабораторные показатели функции эндотелия

Подробнее

Пресс-служба ФГБУ РДКБ МЗ РФ.

Пресс-служба ФГБУ РДКБ МЗ РФ. Пресс-служба ФГБУ РДКБ МЗ РФ www.rdkb.ru Предсуществующие анти-hla и MICA антитела, отмена их влияния при трансплантации почки Грачева Л. А., Харламова Л. А., Петрова Л. В., Румянцев А. Л., Валов А. Л.,

Подробнее

Срок освоения ОПОП: 6 лет (нормативный срок обучения)

Срок освоения ОПОП: 6 лет (нормативный срок обучения) ЧАСТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ УНИВЕРСИТЕТ «РЕАВИЗ» АННОТАЦИЯ РАБОЧЕЙ ПРОГРАММЫ ДИСЦИПЛИНЫ «ИММУНОЛОГИЯ» Блок 1 Базовая часть Направление подготовки 31.05.01 Лечебное

Подробнее

2. Задачи, решаемые в ходе освоения программы дисциплины:

2. Задачи, решаемые в ходе освоения программы дисциплины: 1. Целью изучения дисциплины является: Целью изучения дисциплины «Болезни, связанные с нарушениями в иммунной системе в практике врача амбулаторнополиклинического звена» является изучение общих закономерностей

Подробнее

Программа. вступительного экзамена по специальности «Клиническая иммунология, аллергология»

Программа. вступительного экзамена по специальности «Клиническая иммунология, аллергология» Программа вступительного экзамена по специальности 14.03.09 «Клиническая иммунология, аллергология» Предмет и задачи иммунологии. Исторические этапы развития иммунологии. Нобелевские премии по иммунологии.

Подробнее

''Утверждаю'' И.о. зав.кафедрой А.Т.Яковлев «30» августа 2016 г.

''Утверждаю'' И.о. зав.кафедрой А.Т.Яковлев «30» августа 2016 г. п/п ''Утверждаю'' И.о. зав.кафедрой А.Т.Яковлев «30» августа 2016 г. КАЛЕНДАРНО-ТЕМАТИЧЕСКИЙ ПЛАН практических занятий по дисциплине «Клиническая лабораторная диагностика: Лабораторная аналитика, Менеджмент

Подробнее

Иммунитет - защита организма от чужеродный веществ для выживания

Иммунитет - защита организма от чужеродный веществ для выживания Лекция 11 Биохимия иммунной системы. Гуморальный и клеточный иммунитет. Исскуственные и природные антигены. Чужие антигены. Иммуноглобулины. Химическая структура и образование иммуноглобулинов. Взаимодействие

Подробнее

Ведущим направлением исследований ЦНИЛ, являются технологии : имеющие выход на решение задач практической медицины, входящие в список приоритетных

Ведущим направлением исследований ЦНИЛ, являются технологии : имеющие выход на решение задач практической медицины, входящие в список приоритетных Стратегия и перспективы развития науки и инноваций ЦНИЛ 2016год Ведущим направлением исследований ЦНИЛ, являются технологии : имеющие выход на решение задач практической медицины, входящие в список приоритетных

Подробнее

ОТЗЫВ ОФИЦИАЛЬНОГО ОППОНЕНТА

ОТЗЫВ ОФИЦИАЛЬНОГО ОППОНЕНТА Федеральное агентство научных организаций (ФАНО России) Федеральное государственное бюджетное учреждение науки ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ или академиков М.М. Шемякина и Ю.Л. Овчинникова Российской

Подробнее

Инфекции органов малого таза: имеет ли место эмпирическая терапия? г. Владивосток, 14 сентября 2016 г. Хрянин А.А. д.м.н.

Инфекции органов малого таза: имеет ли место эмпирическая терапия? г. Владивосток, 14 сентября 2016 г. Хрянин А.А. д.м.н. Инфекции органов малого таза: имеет ли место эмпирическая терапия? г. Владивосток, 14 сентября 2016 г. Хрянин А.А. д.м.н., профессор Национальные стандарты первичной помощи при ВЗОМТ Источник www.rosminzdrav.ru

Подробнее

ведущей организации Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Курский

ведущей организации Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Курский «УТВЕ РЖДАЮ» Проректор по научной работе ава России 2019г. ведущей организации Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Курский государственный медицинский

Подробнее

ОТЗЫВ ОФИЦИАЛЬНОГО ОППОНЕНТА

ОТЗЫВ ОФИЦИАЛЬНОГО ОППОНЕНТА ОТЗЫВ ОФИЦИАЛЬНОГО ОППОНЕНТА доктора медицинских наук, профессора В.В. Флоренсова на диссертационную работу И.А. Невзоровой «Клиническое значение маркеров эндотелиальной дисфункции при отслойке хориона

Подробнее

«ИЗМЕНЕНИЯ УРОВНЕЙ ЭКСПРЕССИИ РЯДА ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИ АКТУАЛЬНЫХ ГЕНОВ У ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНЬЮ ЛЕГКИХ»

«ИЗМЕНЕНИЯ УРОВНЕЙ ЭКСПРЕССИИ РЯДА ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИ АКТУАЛЬНЫХ ГЕНОВ У ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНЬЮ ЛЕГКИХ» «ИЗМЕНЕНИЯ УРОВНЕЙ ЭКСПРЕССИИ РЯДА ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИ АКТУАЛЬНЫХ ГЕНОВ У ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНЬЮ ЛЕГКИХ» Исполнитель: очный аспирант кафедры клинической лабораторной диагностики с

Подробнее

Современные методы определения СРБ, РФ, АСО и их использование в диагностике

Современные методы определения СРБ, РФ, АСО и их использование в диагностике Современные методы определения СРБ, РФ, АСО Сыропятова Екатерина Олеговна врач клинической лабораторной диагностики, продакт-менеджер по направлению клиническая биохимия ООО НПФ «АБРИС+». Санкт-Петербург

Подробнее

Ю.С. Полушин «15» апреля 2015 г. ОТЗЫВ

Ю.С. Полушин «15» апреля 2015 г. ОТЗЫВ «УТВЕРЖДАЮ» Проректор по научной работе ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский Государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, член-корреспондент

Подробнее

SN-полиморфизмы генов воспаления и соединительной ткани в развитии сепсиса и его исхода у тяжелообожженных

SN-полиморфизмы генов воспаления и соединительной ткани в развитии сепсиса и его исхода у тяжелообожженных УЗ «Городская клиническая больница скорой медицинской помощи» г. Минска УО «Белорусский государственный медицинский университет» Кафедра общей хирургии SN-полиморфизмы генов воспаления и соединительной

Подробнее

Инфекции и соматические заболевания. Н.И. Яблучанский

Инфекции и соматические заболевания. Н.И. Яблучанский Инфекции и соматические заболевания Н.И. Яблучанский Почему такой интерес? Живем в мире микроорганизмов и всегда проблема сосуществования Антропогенный прессинг на окружающую среду не в пользу человека

Подробнее

Актуальность темы выполненной работы

Актуальность темы выполненной работы Отзыв Вишневского Валерия Ивановича, официального оппонента, доктора медицинских наук, профессора, заведующего кафейзой внутренних болезней федерального государственного бюджетного образовательного учреждения

Подробнее

1. Актуальность диссертационной работы.

1. Актуальность диссертационной работы. Отзыв официального оппонента на диссертационную работу Далгатовой Асеры Арабхановны «Патогенетическая значимость изменений адаптивного иммунитета при синдроме длительного сдавления» (экспериментальное

Подробнее

иммунного статуса пациента. Поскольку принципиально невозможно полностью исследовать все механизмы функционирования иммунной системы, необходимо

иммунного статуса пациента. Поскольку принципиально невозможно полностью исследовать все механизмы функционирования иммунной системы, необходимо отзыв официального оппонента на диссертацию Сарапа Павла Владимировича «Оптимизация иммунотропной терапии при ургентной хирургической патологии с учетом кластерной организации иммунной системы», представленной

Подробнее

Впервые определены дополнительные факторы риска диабетической нефропатии у детей: низкая масса при рождении, наличие сочетанных микрососудистых

Впервые определены дополнительные факторы риска диабетической нефропатии у детей: низкая масса при рождении, наличие сочетанных микрососудистых отзыв на автореферат диссертации Кисельниковой Ольги Викторовны на тему «Прогнозирование и ранняя диагностика диабетической нефропатии у детей», представленной на соискание ученой степени кандидата медицинских

Подробнее

Иммунологические аспекты ожирения и сахарного диабета 2 типа

Иммунологические аспекты ожирения и сахарного диабета 2 типа Иммунологические аспекты ожирения и сахарного диабета 2 типа В.В. Попова, К.П. Зак ДУ «Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка Національної академії медичних наук України» В современной

Подробнее

Актуальность темы исследования Степень обоснованности научных положений, выводов и рекомендаций Новизна научных положений, выводов и рекомендаций

Актуальность темы исследования Степень обоснованности научных положений, выводов и рекомендаций Новизна научных положений, выводов и рекомендаций отзыв официального оппонента на диссертационную работу Немченко Ирины Семеновны на тему «Миелопролиферативные заболевания, протекающие с эозинофилией: клиника, диагностика, лечение», представленную на

Подробнее

УТВЕРЖДАЮ Заместитель директора по науке и международным связям ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского наук, профессор Мол очков А.В.

УТВЕРЖДАЮ Заместитель директора по науке и международным связям ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского наук, профессор Мол очков А.В. УТВЕРЖДАЮ Заместитель директора по науке и международным связям ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского наук, профессор Мол очков А.В. 2017г ОТЗЫВ ведущей организации государственного бюджетного учреждения

Подробнее

Функциональное состояние эндотелия при болезнях почек играет важную роль с учетом того, что его клетки участвуют в регуляции внутрипочечных

Функциональное состояние эндотелия при болезнях почек играет важную роль с учетом того, что его клетки участвуют в регуляции внутрипочечных ОТЗЫВ официального оппонента профессора кафедры госпитальной терапии им. В.Г. Вогралика государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Нижегородская государственная

Подробнее

И.Г. Мустафин : Ж&» 2018 г.

И.Г. Мустафин : Ж&» 2018 г. УТВЕРЖДАЮ Проректор по научной и инновационной работе Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Казанский государственный медицинский университет» нистерства

Подробнее

сравниваемых группах в ближайшем послеоперационном и отдаленном периодах

сравниваемых группах в ближайшем послеоперационном и отдаленном периодах отзыв официального оппонента на диссертацию Максименко Анастасии Васильевны «Повышение эффективности лечения больных ишемической болезнью сердца с низкой фракцией выброса левого желудочка», представленную

Подробнее

Профиль медицинской помощи в рамках которого запланировано проведение научного исследования

Профиль медицинской помощи в рамках которого запланировано проведение научного исследования Разработка и внедрение новых молекулярно-генетических и протеомных подходов для диагностики первичных и вторичных кардиомиопатий с целью подбора персонифицированной терапии и прогнозирования. Актуальность

Подробнее

памяти, плазматических клеток и плазмобластов, может помочь достичь решения поставленных задач. Таким образом, тема диссертации Меснянкиной Анны

памяти, плазматических клеток и плазмобластов, может помочь достичь решения поставленных задач. Таким образом, тема диссертации Меснянкиной Анны отзыв официального оппонента доктора медицинских наук, профессора, членакорреспондента РАН Алексеевой Екатерины Иосифовны на диссертационную работу Меснянкиной Анны Александровны «Динамика субпопуляций

Подробнее

БОЛЕЗНЬ КОРОНАРНЫХ АРТЕРИЙ ПЕРЕСАЖЕННОГО СЕРДЦА. Под редакцией академика В.И. Шумакова

БОЛЕЗНЬ КОРОНАРНЫХ АРТЕРИЙ ПЕРЕСАЖЕННОГО СЕРДЦА. Под редакцией академика В.И. Шумакова БОЛЕЗНЬ КОРОНАРНЫХ АРТЕРИЙ ПЕРЕСАЖЕННОГО СЕРДЦА Под редакцией академика В.И. Шумакова МЕДИЦИНСКОЕ ИНФОРМАЦИОННОЕ АГЕНТСТВО МОСКВА 2008 УДК 616.13 ББК 54.101 Б79 Б79 Болезнь коронарных артерий пересаженного

Подробнее

Отзыв. обоснование целесообразности нового подхода к лечению этого заболевания,

Отзыв. обоснование целесообразности нового подхода к лечению этого заболевания, Отзыв на диссертацию Кисиевой Залины Ахсарбековны «Функционально-морфологическая характеристика, экспериментальная профилактика и терапия моделей нефропагического типа амилоидоза у сирийских хомяков»,

Подробнее

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ЛЕЧЕНИЮ АНЕМИИ У БОЛЬНЫХ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ НОВООБРАЗОВАНИЯМИ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ЛЕЧЕНИЮ АНЕМИИ У БОЛЬНЫХ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ НОВООБРАЗОВАНИЯМИ Проект рабочей группы RUSSCO по поддерживающей терапии: индивидуализация поддерживающей терапии (коррекция анемии, нейтропении и назначение остеомодифицирующих агентов) ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ЛЕЧЕНИЮ

Подробнее

ОТЗЫВ ОФИЦИАЛЬНОГО ОППОНЕНТА

ОТЗЫВ ОФИЦИАЛЬНОГО ОППОНЕНТА ОТЗЫВ ОФИЦИАЛЬНОГО ОППОНЕНТА доктора медицинских наук, профессора Котова С.В. на диссертацию Кимельфельд Екатерины Игоревны «Клинико-генетические аспекты ишемического инсульта у пациентов в возрасте до

Подробнее

УГТЯНПППРННЫР показатели описывают важные особенности клеточной

УГТЯНПППРННЫР показатели описывают важные особенности клеточной отзыв официального оппонента, руководителя Института травматологии и ортопедии ФГБОУ ВО «Приволжский исследовательский медицинский университет» Минздрава России, кандидата медицинских наук, Сергея Геннадьевича

Подробнее

ИММУННАЯ СИСТЕМА. Общие сведения

ИММУННАЯ СИСТЕМА. Общие сведения ИММУННАЯ СИСТЕМА Общие сведения Иммунная система совокупность клеток, тканей и органов, обеспечивающих иммунитет Различные компоненты относят к этой системе по функциональному критерию (выполнение иммунной

Подробнее

Теоретическая значимость исследования обоснована тем, что: доказаны положения, вносящие вклад в расширение представлений о закономерностях развития

Теоретическая значимость исследования обоснована тем, что: доказаны положения, вносящие вклад в расширение представлений о закономерностях развития 1 Заключение комиссии диссертационного совета Д 208.114.01 в Федеральном бюджетном учреждении науки «Центральный научноисследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты

Подробнее

УТВЕРЖДАЮ. Директор УЗ МО МОНИКИ.Ф. Владимирского., профессор / Семенов Д.Ю г.

УТВЕРЖДАЮ. Директор УЗ МО МОНИКИ.Ф. Владимирского., профессор / Семенов Д.Ю г. УТВЕРЖДАЮ Директор УЗ МО МОНИКИ.Ф. Владимирского., профессор / Семенов Д.Ю. 2018 г. ОТЗЫВ ведущей организации Государственного бюджетного учреждения здравоохранения Московской области «Московский областной

Подробнее

Отзыв. Актуальность темы

Отзыв. Актуальность темы Отзыв официального оппонента - доктора медицинских наук, старшего научного сотрудника отделения клинической гематологии и иммунотерапии государственного бюджетного учреждения здравоохранения Московской

Подробнее

ДИАГНОСТИКА ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ЛЕКАРСТВЕННЫМ СРЕДСТВАМ С ПОМОЩЬЮ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОФЛУОРИМЕТРИИ

ДИАГНОСТИКА ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ЛЕКАРСТВЕННЫМ СРЕДСТВАМ С ПОМОЩЬЮ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОФЛУОРИМЕТРИИ ДИАГНОСТИКА ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ЛЕКАРСТВЕННЫМ СРЕДСТВАМ С ПОМОЩЬЮ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОФЛУОРИМЕТРИИ Пичугина Л.В., Менеджер по продукции ЗАО «БиоХимМак Диагностика» Согласно определению ВОЗ нестандартной

Подробнее

Научнотехническая. программа: Головная организация:

Научнотехническая. программа: Головная организация: Научнотехническая программа: Головная организация: Соисполнитель: Цель программы Задачи программы «Новые медицинские технологии для улучшения результатов лечения хронических заболеваний и последствий травм

Подробнее

МФК осеннего семестра 2015/16 уч. г. Название на английском языке: Conversations about immunology

МФК осеннего семестра 2015/16 уч. г. Название на английском языке: Conversations about immunology Название: "Беседы об иммунологии". МФК осеннего семестра 2015/16 уч. г. Название на английском языке: Conversations about immunology Трудоемкость (объем в аудиторных часах) 24 ч (12 лекций). Форма отчетности

Подробнее

«УТВЕРЖДАЮ» Ректор Института усовершенствования врачей федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный медикохирургический

«УТВЕРЖДАЮ» Ректор Института усовершенствования врачей федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный медикохирургический «УТВЕРЖДАЮ» Ректор Института усовершенствования врачей федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный медикохирургический Центр имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской

Подробнее

Рабочая программа дисциплины

Рабочая программа дисциплины МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Омский государственный университет им. Ф. М.

Подробнее

из которых более 90% будут иметь СД 2 типа. Социальная значимость СД

из которых более 90% будут иметь СД 2 типа. Социальная значимость СД «УТВЕРЖ ДАЮ» «гницпм» ава России профессор.а. Бойцов 2014г. ОТЗЫВ ведущего учреждения - Федерального государственного бюджетного учреждения «Государственный научно-исследовательский центр профилактической

Подробнее

ОТЗЫВ ОФИЦИАЛЬНОГО ОППОНЕНТА на диссертационную работу Гаджиева Газимагомеда Дибирдадаевича «Оптимизация оказания медицинской помощи при крупных и

ОТЗЫВ ОФИЦИАЛЬНОГО ОППОНЕНТА на диссертационную работу Гаджиева Газимагомеда Дибирдадаевича «Оптимизация оказания медицинской помощи при крупных и ОТЗЫВ ОФИЦИАЛЬНОГО ОППОНЕНТА на диссертационную работу Гаджиева Газимагомеда Дибирдадаевича «Оптимизация оказания медицинской помощи при крупных и коралловидных камнях единственной или единственно-функционирующей

Подробнее

Основные разделы курса иммунологии.

Основные разделы курса иммунологии. Основные разделы курса иммунологии. 1. Принципы распознавания чужеродных агентов клетками врожденного иммунитета. Патогенраспознающие рецепторы и связанные с ними сигнальные пути. 2. Фагоцитоз. Фагоцитирующие

Подробнее

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИТЕЛ К КОМПЛЕКСУ ТФ4-ГЕПАРИН С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ACL AcuStar

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИТЕЛ К КОМПЛЕКСУ ТФ4-ГЕПАРИН С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ACL AcuStar ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИТЕЛ К КОМПЛЕКСУ ТФ4-ГЕПАРИН С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ACL AcuStar Морозов Ю.А. Российский научный центр хирургии имени академика Б.В. Петровского РАМН, Москва ПОЧЕМУ ПРОБЛЕМА ГИТ МАЛОИЗВЕСТНА ВРАЧАМ?

Подробнее

ОТЗЫВ официального оппонента доктора медицинских наук Кошкина Сергея Владимировича

ОТЗЫВ официального оппонента доктора медицинских наук Кошкина Сергея Владимировича ОТЗЫВ официального оппонента доктора медицинских наук Кошкина Сергея Владимировича о диссертационной работе Топычкановой Елизаветы Павловны на тему: «Характеристика особенностей системного воспаления у

Подробнее

Теоретическая значимость исследования обоснована тем, что: доказаны положения о целесообразности применения не менее двух неинвазивных методов

Теоретическая значимость исследования обоснована тем, что: доказаны положения о целесообразности применения не менее двух неинвазивных методов 1 Заключение комиссии диссертационного совета Д 208.114.01 в Федеральном бюджетном учреждении науки «Центральный научноисследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты

Подробнее

Актуальность изучения нуммулярной экземы обусловлена ее широкой. длительным. мероприятий,

Актуальность изучения нуммулярной экземы обусловлена ее широкой. длительным. мероприятий, «УТВЕРЖДАЮ» Первый проректор - проректор по научной работе ФГ АОУ ВО «Российский университет дружбы народов» ОТЗЫВ ВЕДУЩЕЙ ОРГАНИЗАЦИИ Федеральное государственное автономное образовательное учреждение

Подробнее

Использование антигенов поверхностной мембраны клеток крови для иммунофенотипической диагностики гематологических заболеваний.

Использование антигенов поверхностной мембраны клеток крови для иммунофенотипической диагностики гематологических заболеваний. 1.2.5. Использование антигенов поверхностной мембраны клеток крови для иммунофенотипической диагностики гематологических заболеваний. Возможности ИФТ в прогнозировании течения и исхода онкогематологических

Подробнее

В связи с чем, важное значение имеет изучение особенностей маточной гемодинамики и ангиогенных факторов роста, как прогностических маркеров

В связи с чем, важное значение имеет изучение особенностей маточной гемодинамики и ангиогенных факторов роста, как прогностических маркеров ОТЗЫВ официального оппонента на диссертацию Лысяка Дениса Сергеевича на тему: «Репродуктивное здоровье женщин, имевших нарушения менструальной функции в пубертатном периоде» на соискание ученой степени

Подробнее

Диагностика ВГЦ. Денис Годлевский Баку, Декабрь 2014

Диагностика ВГЦ. Денис Годлевский Баку, Декабрь 2014 Диагностика ВГЦ Денис Годлевский Баку, Декабрь 2014 Виды диагностики Лабораторная Экспресс-диагностика Темы Антитела/ Неструктурные белки Полимеразная цепная реакция (ПЦР) Генотипирование Фибросканирование

Подробнее

Архангельская областная научнопрактическая. «Актуальные вопросы нефрологии и трансплантологии»

Архангельская областная научнопрактическая. «Актуальные вопросы нефрологии и трансплантологии» Архангельская областная научнопрактическая конференция «Актуальные вопросы нефрологии и трансплантологии» ПРОГРАММА г. Архангельск Архангельская областная научнопрактическая конференция «Актуальные вопросы

Подробнее

Иммунный ответ. Донецкова А.Д., д.м.н., в.н.с., лаборатория дифференцировки лимфоцитов. Москва, 2017 г.

Иммунный ответ. Донецкова А.Д., д.м.н., в.н.с., лаборатория дифференцировки лимфоцитов. Москва, 2017 г. Иммунный ответ Донецкова А.Д., д.м.н., в.н.с., лаборатория дифференцировки лимфоцитов Москва, 2017 г. Основные события, лежащие в основе иммунитета www.nrcii.ru Патогены Схема иммунной защиты Дендритная

Подробнее

Цитологический анализ крови

Цитологический анализ крови Цитологический анализ крови Описание кровяных тел Эритроциты Норма для человека: 110-140 шт. в единичном образце Проявляются при специальной окраске. Основной функцией эритроцитов является перенос кислорода

Подробнее

ОТЗЫВ ВЕДУЩЕЙ ОРГАНИЗАЦИИ

ОТЗЫВ ВЕДУЩЕЙ ОРГАНИЗАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАЦИОНАЛЬНЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР ИМЕНИ В.А. АЛМАЗОВА» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ УТВЕРЖДАЮ Заместитель генерального

Подробнее

грируют преимущественно в опухолевую ткань. Но данные последних лет свидетельствуют о том, что трансплантированные МСК обнаруживаются не только в

грируют преимущественно в опухолевую ткань. Но данные последних лет свидетельствуют о том, что трансплантированные МСК обнаруживаются не только в «УТВЕРЖДАЮ» 2016 г. ОТЗЫВ ведущей организации - Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Институт молекулярной патологии и патоморфологии» - о научно-практической значимости диссертации

Подробнее

Персонализированная медицина «Рош»: стратегия, уникальность и конкурентное преимущество

Персонализированная медицина «Рош»: стратегия, уникальность и конкурентное преимущество Персонализированная медицина - наиболее часто задаваемые вопросы Персонализированная медицина «Рош»: стратегия, уникальность и конкурентное преимущество Почему «Рош» активно развивает идею персонализированной

Подробнее

Паспорт фонда оценочных средств

Паспорт фонда оценочных средств 1 Паспорт фонда оценочных средств п/п Контролируемые разделы (темы) дисциплины* 1 История возникновения и основные открытия в иммунологии Код контролируемой компетенции (или ее части) ПК-4, ПК-5 Наименование

Подробнее

«Беседы об иммунитете и здоровье»

«Беседы об иммунитете и здоровье» Межфакультетский учебный курс «Беседы об иммунитете и здоровье» Беседа 3 На каком языке разговаривают клетки иммунной системы? Сергей Артурович НЕДОСПАСОВ 28 февраля 2018 г. Барьеры и стены в нашем организме:

Подробнее

ОТЗЫВ Актуальность темы диссертации

ОТЗЫВ Актуальность темы диссертации ОТЗЫВ официального оппонента доктора медицинских наук, профессора, заместителя директора по научной работе СПб филиала ФГАУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России И.Е. Пановой

Подробнее

Актуальность темы исследования

Актуальность темы исследования отзыв официального оппонента, доктора медицинских наук, профессора Заводовского Бориса Валерьевича на диссертационную работу Румянцевой Дарьи Гаврильевны на тему «Ранний аксиальный спондилоартрит: особенности

Подробнее

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ СОСТАВЛЯЮЩАЯ ДИСФУНКЦИИ ЭНДОТЕЛИЯ В ФОРМИРОВАНИИ ЗАБОЛЕВАНИЙ ОТ ФИЗИЧЕСКОГО ПЕРЕНАПРЯЖЕНИЯ

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ СОСТАВЛЯЮЩАЯ ДИСФУНКЦИИ ЭНДОТЕЛИЯ В ФОРМИРОВАНИИ ЗАБОЛЕВАНИЙ ОТ ФИЗИЧЕСКОГО ПЕРЕНАПРЯЖЕНИЯ Невзорова Марина Сергеевна ПАТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ СОСТАВЛЯЮЩАЯ ДИСФУНКЦИИ ЭНДОТЕЛИЯ В ФОРМИРОВАНИИ ЗАБОЛЕВАНИЙ ОТ ФИЗИЧЕСКОГО ПЕРЕНАПРЯЖЕНИЯ Малютина Наталья Николаевна, заведующая кафедрой профессиональных

Подробнее

Актуальность темы диссертации

Актуальность темы диссертации ОТЗЫВ ОФИЦИАЛЬНОГО ОППОНЕНТА доктора медицинских наук, профессора Кирьяновой Веры Васильевны На диссертацию Царёвой Ульяны Валерьевны «Клинико-патогенетическое обоснование применения транскраниальной электростимуляции

Подробнее

ЗУРОЧКА А.В.,., ХАЙДУКОВ С.В. г. Челябинск г. Москва

ЗУРОЧКА А.В.,., ХАЙДУКОВ С.В. г. Челябинск г. Москва ИЗМЕНЕНИЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЙ ОБ ОЦЕНКЕ ИММУННОГО СТАТУСА ЧЕЛОВЕКА, НОВЫЕ ПРОБЛЕМЫ И ПОДХОДЫ К ИХ РЕШЕНИЮ ЗУРОЧКА А.В.,., ХАЙДУКОВ С.В. г. Челябинск г. Москва 1.Для чего нужна иммунограмма? 2.Чтодолжнобытьв

Подробнее

Отзыв Актуальность темы диссертации

Отзыв Актуальность темы диссертации Отзыв официального оппонента доктора медицинских наук Мушковой Ирины Альфредовны на диссертацию Полуниной Елизаветы Геннадьевны на тему: «Комплексная система персонализированных мероприятий по диагностике

Подробнее

профессионального образования «Смоленская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

профессионального образования «Смоленская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации. профессионального образования «Смоленская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Научный руководитель: Маслова Наталья Николаевна профессор, доктор медицинских

Подробнее

ОТЗЫВ ВЕДУЩЕЙ ОРГАНИЗАЦИИ

ОТЗЫВ ВЕДУЩЕЙ ОРГАНИЗАЦИИ «УТВЕРЖДАЮ» Проректор по научной работе федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени

Подробнее

Ставицкая Н.В., Владимирский М.А., Шилова М.В., Жидак Т.Н. НИИ фтизиопульмонологии Первого МГМУ им. Сеченова, Москва. II Конгресс

Ставицкая Н.В., Владимирский М.А., Шилова М.В., Жидак Т.Н. НИИ фтизиопульмонологии Первого МГМУ им. Сеченова, Москва. II Конгресс Ставицкая Н.В., Владимирский М.А., Шилова М.В., Жидак Т.Н. НИИ фтизиопульмонологии Первого МГМУ им. Сеченова, Москва Латентная туберкулезная инфекция (LTBI) Состояние организма человека, при котором микобактерии

Подробнее

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Медицинского института при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего образования «Чеченский государственный

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Медицинского института при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего образования «Чеченский государственный Размещено на сайте ДГМУ в сети Интернет 18.05.2017г. 1 "УТВЕРЖДАЮ" Первый проректор ФГБОУ ВО ЗАКЛЮЧЕНИЕ Медицинского института при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего

Подробнее

Актуальность темы выполненной работы

Актуальность темы выполненной работы Министерство здравоохранения Российской Федерации УТВЕРЖДАЮ государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «ТЮМЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Подробнее

ОТЗЫВ ведущей организации

ОТЗЫВ ведущей организации УТВЕРЖДАЮ Ректор федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Башкирский государственный медицинский университет» ОТЗЫВ ведущей организации на диссертационную

Подробнее